血管性癡呆動(dòng)物模型研究概述

孫旭，王蕾，趙婧，韓雪

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是一種由腦血管因素引起的以高級皮層功能減退為主要表現(xiàn)的癡呆綜合征，是最常見的癡呆類型之一[1-2]。血管性癡呆以腦血流量（cerebral blood flow，CBF）明顯減少為典型特征。研究表明，亞洲地區(qū)65歲以上人群中癡呆的患病率約為5%，而血管性癡呆占癡呆患者的20%左右[3]。目前，有關(guān)血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制尚未明確，而有關(guān)其臨床科研設(shè)計(jì)方面的動(dòng)物模型亦無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[1]。開展臨床研究的條件要求較多，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的可控性較好。選擇合適的動(dòng)物模型是進(jìn)行醫(yī)學(xué)研究的前提。目前，動(dòng)物模型仍為研究血管性癡呆發(fā)病機(jī)制、病理學(xué)改變、認(rèn)知功能損害特點(diǎn)和防治措施等的有效工具。以下對近年來血管性癡呆動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇及各類血管性癡呆動(dòng)物模型制備方法進(jìn)行綜述。

1 血管性癡呆動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

血管性癡呆研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要以大鼠、小鼠、沙鼠作為研究對象。近年來有對靈長類動(dòng)物開展的模型研究，但數(shù)量相對較少。目前，血管性癡呆模型的復(fù)制采用大鼠為主，因大鼠具有與人類相似度較高的血管分布。同時(shí)，大鼠來源經(jīng)濟(jì)易得，且易存活，便于進(jìn)行動(dòng)物智能測試及電生理檢查。因而大鼠是建立腦缺血模型最理想的動(dòng)物。此外，C57BL/6品系小鼠的應(yīng)用也較廣泛。C57BL/6品系小鼠具有發(fā)育不良的Willis環(huán)，更容易誘導(dǎo)低灌注模型。

2 血管性癡呆動(dòng)物模型及其制備方法

根據(jù)模型復(fù)制的病理機(jī)制，血管性癡呆動(dòng)物模型主要分為慢性腦低灌注動(dòng)物模型、慢性腦低灌注混合模型、局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀⑷毖俟嘧?dòng)物模型。

2.1 慢性腦低灌注動(dòng)物模型及其制備方法慢性腦低灌注動(dòng)物模型的復(fù)制通常采用雙側(cè)頸動(dòng)脈閉塞法（bilateral carotid artery occlusion，BCAO），主要用于模擬皮層下血管性認(rèn)知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）的發(fā)病機(jī)制[4]。但BCAO只能揭示VCI單一的發(fā)病機(jī)制。Tomimoto H等[5]提出慢性腦低灌注通過激活Caspase通路而導(dǎo)致腦白質(zhì)最先受累，可做為血管性癡呆和腦血管白質(zhì)病變的模型。研究[6]表明，低灌注可導(dǎo)致內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞，包括氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的功能失調(diào)、線粒體功能障礙、脂質(zhì)代謝障礙和生長因子改變等。雙側(cè)頸動(dòng)脈閉塞可通過兩血管阻斷法（2-VO）、兩血管狹窄法等實(shí)現(xiàn)。

2.1.1 兩血管阻斷法（two-vessel occlusion，2-VO）及其改良永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid arteries，CCA）造成慢性腦低灌注狀態(tài)是目前2-VO的經(jīng)典模型。最初Wakita H等[7]將2-VO作為可導(dǎo)致繼發(fā)性白質(zhì)損傷的腦缺氧模型的建立方法。現(xiàn)2-VO經(jīng)典模型已被用于研究白質(zhì)損傷的生理病理學(xué)，并被用于探索血管性癡呆的治療干預(yù)措施[8]。Washida K等[9]用“0”號絲線結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，使腦皮質(zhì)和胼胝體的腦血流量（cerebral blood flow，CBF）在術(shù)后1~3 d下降到原水平的30%~50%，3 d后腦血流量開始恢復(fù)，術(shù)后8周至3個(gè)月，則基本恢復(fù)。Xu C等[10]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在BCAO術(shù)后14 d，其腦血流量急劇下降，術(shù)后21 d恢復(fù)正常水平；BCAO術(shù)后大鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，無明顯感覺運(yùn)動(dòng)功能障礙[11]，這些術(shù)后表現(xiàn)有助于血管性癡呆行為學(xué)的測試。在慢性腦低灌注狀態(tài)所致的血管性癡呆動(dòng)物模型中，各種行為學(xué)測試（如Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、八臂徑向迷宮實(shí)驗(yàn)、T型迷宮實(shí)驗(yàn)和新型物體識別測試）均表現(xiàn)出認(rèn)知記憶受損，相比急性期，慢性期的認(rèn)知損害更嚴(yán)重[9]。組織學(xué)研究[12]結(jié)果顯示，2-VO術(shù)后大鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元固縮，細(xì)胞表面積減小，核仁缺失，14 d后出現(xiàn)白質(zhì)脫髓鞘改變。需要注意的是，由于2-VO術(shù)后大鼠的視神經(jīng)嚴(yán)重?fù)p傷，行為學(xué)評估應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎。

結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈可造成大鼠嚴(yán)重腦損傷及應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致大鼠死亡率升高。針對此問題，近年來學(xué)者不斷對2-VO進(jìn)行改良，以使之更好地適用于臨床科研。其中，Sarti C等[13]改良的動(dòng)物模型具體操作如下：用氟烷麻醉大鼠后，取頸部正中切口，避開甲狀腺分離皮下脂肪組織，切斷肩胛舌骨肌，在光學(xué)顯微鏡下暴露頸總動(dòng)脈，用絲線結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈，1周后（鄭敏等[14]提出將分次結(jié)扎間隔時(shí)間設(shè)定為3 d）行相同的手術(shù)結(jié)扎對側(cè)頸總動(dòng)脈。與傳統(tǒng)方法相比，改良后的2-VO阻斷法大大降低了大鼠的死亡率，且可造成與傳統(tǒng)2-VO法造模所致的大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元相似的明顯變性、壞死和凋亡[15]。在Morris水迷宮的定位航行實(shí)驗(yàn)、空間搜索實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果也證實(shí)了分次結(jié)扎頸總動(dòng)脈法對動(dòng)物行為學(xué)的影響與傳統(tǒng)造模方法比較無顯著性差異[16]。

Kitamura A等[17]通過逐漸狹窄的雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞法（two-vessel gradual occlusion，2VGO）復(fù)制出與人類慢性腦灌注不足更相似的動(dòng)物模型，從而避免了2-VO大鼠急性腦血流量減少和出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)的缺陷。2VGO模型可誘導(dǎo)選擇性白質(zhì)損傷，而神經(jīng)血管偶聯(lián)仍相對保留。該模型在術(shù)后28 d表現(xiàn)出與2-VO大鼠相似的空間記憶損傷。Tukacs V等[18]發(fā)現(xiàn)2VGO適用于長期慢性缺血的模型，且在降低腦血流量方面比雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄法（bilateral carotid artery stenosis，BCAS）效果明顯，可應(yīng)用于觀察低灌注對視網(wǎng)膜和視皮層功能的影響。2VGO模型可出現(xiàn)脫髓鞘改變，伴有炎癥和神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)，但無明顯的梗死病變或灰質(zhì)的代謝紊亂。因此，與2-VO比較，該模型更能準(zhǔn)確模擬人類缺血性白質(zhì)改變后的工作記憶損傷。

2.1.2 兩血管狹窄法雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄法（BCAS）是通過在頸動(dòng)脈周圍放置部分阻塞的微線圈引起的，線圈的直徑可影響阻塞的嚴(yán)重程度。Poh L等[19]認(rèn)為，0.18 mm線圈在術(shù)后2 h內(nèi)可引起腦血流量減少（與基線水平相比），1~3個(gè)月后，腦血流量可恢復(fù)到基線水平的80%~85%，而血壓未受到影響。Poh L等[20]的另一研究采用專門為小鼠設(shè)計(jì)的微膠囊（日本Sawane Spring有限公司生產(chǎn)）誘導(dǎo)慢性低灌注模型，發(fā)現(xiàn)小鼠術(shù)后15、30 d的腦血流量明顯減少，證實(shí)了小腦凋亡參與慢性低灌注血管性癡呆小鼠的代謝過程，且BCAS誘導(dǎo)的腦血流量下降水平優(yōu)于大鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈閉塞（BCAO）模型。BCAS可誘發(fā)腦白質(zhì)病變，其嚴(yán)重程度與腦灌注不足程度密切相關(guān)[21]，因此，BCAS模型主要以空間工作記憶障礙為主。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、八臂徑向迷宮實(shí)驗(yàn)中可觀察到BCAS模型動(dòng)物在術(shù)后1個(gè)月，其空間工作記憶能力下降，在5~6個(gè)月后，仍可觀察到其廣泛的記憶受損。組織學(xué)研究[19]顯示，BCAS后有廣泛的神經(jīng)元缺失，即在海馬CA1、CA2、CA3區(qū)可見神經(jīng)元明顯受損；7 d后，CA2、CA3區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)更明顯的損傷；8個(gè)月后可觀察到明顯的海馬萎縮；甲酚紫和MAP2染色結(jié)果顯示海馬神經(jīng)元丟失。

2.2 慢性腦低灌注混合模型Torre J C等[22]發(fā)現(xiàn)BCAO可使大腦海馬區(qū)供血減少22%~30%，4周后血流維持穩(wěn)定。鑒于結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后Willis環(huán)的代償作用，腦血流下降是短暫的，通過動(dòng)物腹腔注射硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）、尾動(dòng)脈放血、頸動(dòng)脈加壓等方法可降低全身血壓，減弱Willis環(huán)的代償作用，從而增加造模的成功率和模型的可靠性。

2.2.1 2-VO+腹腔注射硝普鈉（SNP）模型王蕊等[23]通過先采用腹腔注射硝普鈉（2.5 mg/kg），后采用無創(chuàng)動(dòng)脈夾結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法創(chuàng)建腦低灌注的動(dòng)物模型。此法采用腹腔注射硝普鈉能降低大鼠血壓，減少腦灌注，可抑制Willis環(huán)的調(diào)節(jié)、代償作用，30 min后大鼠血壓恢復(fù)到給藥前水平。Wei B Y等[24]發(fā)現(xiàn)，2-VO+腹腔注射硝普鈉模型大鼠的空間學(xué)習(xí)能力和參考記憶均受損，且空間學(xué)習(xí)能力受損程度較2-VO大鼠嚴(yán)重。2-VO+硝普鈉（2.5 mg/kg）組大鼠認(rèn)知功能障礙較2-VO+硝普鈉（2.0 mg/kg）組大鼠更為穩(wěn)定，前者可引起更全面的認(rèn)知障礙。此混合模型主要以學(xué)習(xí)記憶能力低下為主要特點(diǎn)，無明顯運(yùn)動(dòng)行為學(xué)損傷。術(shù)后第7天左右，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺實(shí)驗(yàn)可觀察到學(xué)習(xí)和記憶功能受損。該模型形態(tài)學(xué)的變化表現(xiàn)為大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞線模糊，錐體細(xì)胞缺失，細(xì)胞數(shù)量明顯減少；尼氏體染色可見其胞質(zhì)內(nèi)尼氏體減少，尤以CA1區(qū)最明顯。

2.2.2 2-VO+尾動(dòng)脈放血此方法主要用于復(fù)制小鼠VD模型。雙側(cè)頸動(dòng)脈閉塞法加上尾動(dòng)脈放血可有效復(fù)制腦缺血模型，表現(xiàn)為腦低灌注顯著，術(shù)后小鼠有明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙。此外，該法復(fù)制的模型可降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)激所致的高血壓。為保證動(dòng)物的存活，放血量應(yīng)控制在10%以內(nèi)，術(shù)畢應(yīng)腹腔注入生理鹽水以補(bǔ)充血容量。但此法可增加感染率，同時(shí)對動(dòng)物水迷宮實(shí)驗(yàn)會造成一定的影響[25]。

2.2.3 2-VO+Aβ1-42腦室內(nèi)注射Dai S J等[26]發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸動(dòng)脈閉塞法聯(lián)合腦室內(nèi)注射β淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）可 促 進(jìn) 大 鼠 阿 爾 茲 海 默 癥（Alzheimer’s disease，AD）的發(fā)展。Aβ1-42可加速大鼠認(rèn)知功能的損害，雙側(cè)頸動(dòng)脈閉塞法引起的腦缺血可促進(jìn)海馬CA1區(qū)Aβ的產(chǎn)生和錐體細(xì)胞的死亡，促進(jìn)AD的發(fā)展。此法為AD伴腦缺血提供了一種耗時(shí)更少的模型，故認(rèn)為，此法可為混合型癡呆提供一種合適的動(dòng)物模型。

2.2.4 2-VO+雙腎雙夾（2K2C）法及其改良Lin J等[27]先通過雙腎雙夾（2K2C）法復(fù)制自發(fā)性高血壓（RHRSP）大鼠模型，在12周后通過尾端血壓計(jì)測量模型大鼠的收縮壓，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞手術(shù)（2-VO）；改良后的2-VO則是在結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈1周后進(jìn)行另一側(cè)結(jié)扎。此法可導(dǎo)致廣泛的腦白質(zhì)病變，與RHRSP大鼠相比，RHRSP+改良2-VO大鼠在術(shù)后12周均表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性和更廣泛的白質(zhì)損傷，但死亡率無明顯增加。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RHRSP+2-VO組及RHRSP+2-VO改良組存在空間認(rèn)知障礙，且RHRSP+2-VO改良組逃避潛伏期明顯高于RHRSP+2-VO組。組織學(xué)研究結(jié)果顯示，RHRSP+改良2-VO組和RHRSP組術(shù)后8周和12周均出現(xiàn)明顯脫髓鞘、空泡形成、神經(jīng)纖維消失等表現(xiàn)。Flores G等[28]認(rèn)為此模型所表現(xiàn)的長程和短程連通性不足可能是導(dǎo)致其認(rèn)知障礙的重要原因。該模型可以更精確地模擬小血管的病理變化。但這個(gè)模型有一個(gè)固有的局限性，即不能忽視的遺傳因素在RHRSP模型中發(fā)揮的作用。

2.3 局灶性腦缺血模型局灶性腦缺血模型模擬了人類永久性腦梗死的病理生理過程，梗死灶固定，重復(fù)性好，可模擬關(guān)鍵部位梗死導(dǎo)致的血管性癡呆。其缺點(diǎn)是該模型在梗死部位、梗死體積和病變嚴(yán)重程度等方面均與人類腦卒中存在差異，且動(dòng)物術(shù)后可能出現(xiàn)嚴(yán)重偏癱癥狀，從而影響其行為學(xué)的檢測。

2.3.1 大腦中動(dòng)脈梗死法趙玲、尹軍祥等[29-30]采用大鼠麻醉后開顱暴露大腦中動(dòng)脈（MCA），將蘸有氯化鐵溶液的濾紙敷在MCA上，待MCA變黑，取下濾紙，縫合傷口；蔡晶等[31]采用電凝器熱凝固MCA主干；尹軍祥等[30]將尼龍線從頸內(nèi)動(dòng)脈插入后實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致腦缺血，2 h后向外提拉線頭使大腦中動(dòng)脈再灌注，復(fù)制大腦中動(dòng)脈梗死線栓模型。大腦中動(dòng)脈梗死法所致的腦缺血效果可靠，MCA供血區(qū)有典型的神經(jīng)細(xì)胞缺血、梗死灶，模型動(dòng)物有明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，缺血灶明確、可重復(fù)性強(qiáng)，但本法操作技巧性要求高，對大鼠造成的創(chuàng)傷較大，死亡率較高。

2.3.2 多發(fā)性腦梗死栓塞法趙小貞等[32]通過顱外安置小磁鐵吸附經(jīng)大鼠尾靜脈注射的四氧化三鐵法實(shí)施多發(fā)性腦梗死栓塞法，術(shù)后大鼠活動(dòng)能力低下，自發(fā)運(yùn)動(dòng)減少，多數(shù)于24 min后恢復(fù)正常。與雙側(cè)頸動(dòng)脈閉塞法相比，此法導(dǎo)致了更嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶障礙，組織形態(tài)學(xué)顯示海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量減少甚至脫失。此法操作簡單，創(chuàng)傷少，重復(fù)性好，模型時(shí)間周期短，在大腦皮層及海馬區(qū)域可見相應(yīng)梗死、軟化灶，能較好地模擬人類多發(fā)性腦梗死。此外，國內(nèi)還有其他實(shí)施血管內(nèi)栓塞導(dǎo)致血管性癡呆的造模方法，如左心室注射液體石蠟?zāi)Ｐ汀⑸嘞蚂o脈注入鐵粉模型線栓法等。

2.4 缺血再灌注動(dòng)物模型缺血再灌注動(dòng)物模型主要用于模擬臨床血管再通性損傷及短暫性腦缺血發(fā)作等研究。缺血再灌注損傷機(jī)制包括自由基的生成、興奮性氨基酸毒性、鈣離子超載等多種因素。該模型的再灌注損傷明顯，腦血流量可見明顯下降，可較好地模擬人類再灌注損傷，但該模型的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究。

Liu H等[33]用尼龍線通過頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入大腦中動(dòng)脈，阻斷90 min后緩慢抽出，使缺血腦組織再灌注，并按照Poh L等[20]的方法對實(shí)驗(yàn)前后大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評定，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)及跳臺實(shí)驗(yàn)評價(jià)大鼠的認(rèn)知功能。Chen C Y等[34]通過阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈和右頸總動(dòng)脈血流，缺血一段時(shí)間后恢復(fù)血流，建立雙血管閉塞小鼠腦缺血再灌注模型。Khan S等[35]用微細(xì)絲阻斷血管，間隔不同時(shí)間后予以再通，發(fā)現(xiàn)缺血時(shí)間短于10 min很難產(chǎn)生缺血性腦損傷，即使在7 d之后也如此。大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）再灌注模型可誘發(fā)穩(wěn)定大小的梗死，產(chǎn)生高度可重復(fù)性的皮層梗死和行為缺損，與雙血管閉塞引起的梗死體積無顯著性差異；在降壓實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，該模型大鼠可表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙；Nissl染色后，可觀察到MCAO再灌注大鼠海馬皮層及海馬CA1區(qū)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元缺失，突觸表達(dá)相關(guān)蛋白含量也明顯降低。

各類血管性癡呆動(dòng)物模型的造模方法、特點(diǎn)及臨床應(yīng)用比較見表1。

表1 各類血管性癡呆動(dòng)物模型的比較Table 1 Comparison of the vascular dementia models estalished by various methods

3 結(jié)語

綜上所述，血管性癡呆動(dòng)物模型制備方法近年來已得到較大發(fā)展。血管性癡呆動(dòng)物模型因制備方法的不同，其病理組織學(xué)改變和認(rèn)知功能損害程度也有所不同，存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)，研究者需針對血管性癡呆的亞型和研究目標(biāo)做出相應(yīng)的選擇。目前，中醫(yī)藥干預(yù)血管性癡呆仍普遍采用西醫(yī)模型的制作方法，評價(jià)指標(biāo)大部分也未涉及中醫(yī)證候評定。在今后構(gòu)建中醫(yī)復(fù)合模型方面，可通過手術(shù)、藥物、高齡等造成腎精虧虛；通過過勞或攝入不足造成氣虛模型；通過高脂飲食構(gòu)建痰濁阻竅型模型；通過2-VO聯(lián)合高血壓病或自發(fā)性高血壓病大鼠構(gòu)建肝陽上亢型模型。但中醫(yī)體質(zhì)的形成是多種因素長期作用下的結(jié)果，臨床實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模時(shí)間普遍較短，大部分動(dòng)物模型與中醫(yī)證候的吻合程度較低，例如腰膝酸軟、頭暈耳鳴、舌脈、二便等證候指標(biāo)難以定量，亦缺乏一定的量化指標(biāo)，在一定程度上限制了中醫(yī)復(fù)合模型的發(fā)展。因此，深入量化動(dòng)物模型的中醫(yī)考核指標(biāo)，結(jié)合爪甲、飲食、行為學(xué)觀察，建立一種指標(biāo)穩(wěn)定、模型重復(fù)率高的可量化模型是中醫(yī)復(fù)合模型未來發(fā)展的重點(diǎn)。