基于“心藏神”探討金絲桃苷對心肌梗死后抑郁大鼠的治療作用及機制

裴玲軍，王小玲，張乃中，章藝子，李潔，王會敏，裴金娜，唐新花

（1.遷安市老干部保健中心，河北 遷安 064400；2.遷安市中醫醫院，河北 遷安 064400）

急性心肌梗死是臨床上常見的危重病癥，其發病率逐年升高，并存在年輕化及復雜化的趨勢[1]。抑郁是心肌梗死患者的常見并發癥，國際研究顯示，心肌梗死患者合并抑郁的發生率為30%~60%，被認為是影響心肌梗死患者預后及死亡的獨立危險因子[2]。有研究[3]表明，心血管疾病可以導致抑郁癥，抑郁癥也可以引起心血管疾病。中醫認為“心藏神”，即心主神志，也就是心主神明，指心具有主宰人體五臟六腑、形體官竅的一切生理活動和人體精神意識思維活動的功能[4]。明代張介賓《類經·臟象類》中謂：“心者，君主之官，神明出焉。”《靈樞·邪客篇》曰：“心者，五臟六腑之大主也，精神之所舍也。”調心神是重要的治療法則。金絲桃苷（hyperoside）是一種存在于連翹、菟絲子、黃蜀葵花、山楂、吳茱萸等中藥植物中的黃酮類化合物，既有保護心血管[5-9]，又有抗抑郁[10]、改善失眠[11-12]的作用，符合調心神治法，體現了“心藏神”的理論內涵。因此，本研究構建心肌梗死后抑郁大鼠模型，觀察金絲桃苷對其治療的作用及機制，以期為心肌梗死后抑郁治療藥物的選擇提供參考依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級健康3~4月齡Wistar大鼠60只，雌雄參半，體質量200~220 g，均購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（粵）2020-0010，飼養在本院實驗動物中心，飼養溫度（22±3）℃，濕度60%。按照動物飼養規定喂養7 d后進行實驗。

1.2 藥物、試劑與儀器金絲桃苷（分子式：C21H20O12；分子量：464.376 3），成都曼斯特生物技術公司生產（批號：MUST18100910），純度99.98%，為淡黃色粉末，以2%二甲基亞砜（DMSO）配制成混懸液保存備用；福辛普利鈉片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：國藥準字H19980197）；烏拉坦（齊魯制藥有限公司，批號：國藥準字H37022259）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號：國藥準字H13020655）。白細胞介素（IL）-1β、腦源性神經營養因子（BDNF）及皮質酮（CORT）酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒[研域（上海）化學試劑公司]；小鼠抗N-甲基-D-天門冬氨酸受體1（NMDAR1）抗體、A型鉀離子通道電壓門控型鉀通道4.2（Kv4.2）抗體（武漢艾美捷科技有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色液（廣州威佳科技有限公司）。動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；SP-2006心電圖解析系統（北京軟隆生物技術有限公司）；高速離心機（德國Eppendorf公司）；蛋白電泳儀（北京六一儀器廠）；心臟電生理刺激儀（上海涵飛醫療器械有限公司）；TBA-120FR全自動生化分析儀（日本東芝公司）。

1.3 心肌梗死后抑郁模型的建立（1）先建立急性心肌梗死模型[13]，方法：給予大鼠腹腔注射烏拉坦（800 mg/kg）與α-氯醛糖（40 mg/kg）麻醉后固定于鼠板上。常規消毒后進行心電圖監測，氣管插管后連接小動物呼吸機（潮氣量：30~40 mL/kg、呼吸頻率70~80次/min）。于第4肋間鈍性分離肋間肌，撕開心包，暴露心臟，左側心耳及肺動脈圓錐的交界及心尖上結扎冠狀動脈前降支。術后觀察到大鼠左室壁慢慢變得蒼白，并且室壁運動逐漸減弱，心電圖ST段出現明顯抬高，提示造模成功[14]。術后1~3 d腹腔注射青霉素40萬U以減少傷口感染。假手術組在結扎時施以活結。（2）再建立抑郁模型[15]。方法：鼠籠45℃傾斜1 d，鼠籠搖晃15 min，禁食禁水1 d，潮濕墊料1 d，行為限制2 h，4℃冷水、42℃熱水均游泳5 min，夾尾1 min，連續光照36 h，捕食者聲音刺激0.5 h。上述內容連續28 d內隨機選擇一種進行刺激，同種刺激不能連續出現。以大鼠伴有探索行為減少、體質量減輕、興趣下降、毛色晦暗等抑郁癥狀為建模成功標準[16]。

1.4 分組與干預方法將60只大鼠分為6組，即假手術組，模型組，金絲桃苷低、中、高劑量組和西藥組，每組10只。除假手術組外，其余大鼠均建立心肌梗死后抑郁模型。建模成功后第1天，金絲桃苷低、中、高劑量組分別給予9、18、36 mg/kg金絲桃苷灌胃，西藥組給予15 mg/kg福辛普利鈉灌胃，模型組和假手術組給予0.01 mL/g生理鹽水灌胃。每日1次，連續灌胃14 d。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 睡眠潛伏期與睡眠時間末次灌胃結束后，給予大鼠腹腔注射50 mg/mL戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉后，仰臥位放置于平板上，當尾部與平板垂直時開始計時，60 s內不翻動為翻正反射消失。將注射時間到翻正反射消失時間作為睡眠潛伏期（SL），持續計時到大鼠仰臥自動翻轉身體為睡眠時間（ST）。

1.5.2 ELISA法檢測血清IL-1β、BDNF、CORT含量末次灌胃后，采集大鼠尾部靜脈血，離心，保留上清液，實驗步驟嚴格按ELISA試劑盒說明書進行操作。實驗完成后立即用酶標儀在450 nm相對630 nm波長處，測定每孔吸光度，繪制標準曲線，計算IL-1β、BDNF、CORT含量。

1.5.3 電生理實驗“1.5.2”項下實驗結束后，利用心臟電生理刺激測定梗死周邊區及遠離梗死區的心室有效不應期（VERP）及心室顫動閾值（VFT）。刺激電壓從起搏閾值開始，每次以1 V遞增直至誘發心室顫動。心室顫動閾值定義為能誘發持續性心室顫動的最小刺激電壓。

1.5.4 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察腦、心肌組織形態處死大鼠后取腦組織、心肌組織，石蠟包埋后4 μm切片，二甲苯脫蠟后按照100%-95%-85%-75%乙醇進行逐層脫水，蘇木精染色10 min，1%鹽酸處理，伊紅復染，100%-95%-85%-75%乙醇脫水，封片后觀察組織形態。

1.5.5 蛋白免疫印跡法檢測心肌組織NMDAR1及Kv4.2蛋白表達取心肌組織裂解，離心，取上清，BCA法進行蛋白定量。上樣后，進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白，轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用PBS緩沖液沖洗5 min，用胎牛血清（BSA）封閉液封閉1.5 h；加 入 小 鼠 抗NMDAR1（1∶1 000）、Kv4.2（1∶3 000）、GAPDH（1∶2 000）等一抗稀釋液，4℃孵育過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標記兔抗小鼠IgG二抗（1∶5 000稀釋）常溫孵育90 min，洗膜后，用電化學發光試劑（ECL）顯影曝光3 min。分析NMDAR1、Kv4.2、GAPDH灰度值，結果以目的蛋白與內參蛋白的灰度值比值表示。實驗重復3次取平均值。

1.6 統計方法采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析。所有數據符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠睡眠潛伏期、睡眠時間比較表1結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠睡眠潛伏期延長，睡眠時間縮短（P＜0.05）；與模型組比較，金絲桃苷低、中、高劑量組和西藥組大鼠睡眠潛伏期縮短，睡眠時間延長（P＜0.05），且中藥組呈劑量依賴性；與西藥組比較，金絲桃苷高劑量組上述指標差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠睡眠潛伏期及睡眠時間比較Table 1 Comparison of sleep latency and sleep duration of rats among various groups（±s）

表1 各組大鼠睡眠潛伏期及睡眠時間比較Table 1 Comparison of sleep latency and sleep duration of rats among various groups（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與西藥組比較

組別假手術組模型組金絲桃苷低劑量組金絲桃苷中劑量組金絲桃苷高劑量組西藥組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 10睡眠潛伏期/s 171±18 381±22①266±19①②③226±17①②③177±16①②179±18①②193.900＜0.001睡眠時間/min 241±32 75±13①154±16①②③171±18①②③196±22①②193±20①②70.050＜0.001

2.2 各組大鼠血清IL-1β、BDNF、CORT水平比較表2結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-1β、BDNF含量降低，CORT含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，金絲桃苷低、中、高劑量組和西藥組大鼠血清IL-1β、BDNF含量升高，CORT含量降低（P＜0.05），且中藥組呈劑量依賴性；與西藥組比較，金絲桃苷高劑量組上述指標差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清白細胞介素（IL）-1β、腦源性神經營養因子（BDNF）及皮質酮（CORT）水平比較Table 2 Comparison of rat serum interleukin（IL）-1β，brain-derived neurotrophic factor（BDNF）and corticosterone（CORT）levels among various groups （±s）

表2 各組大鼠血清白細胞介素（IL）-1β、腦源性神經營養因子（BDNF）及皮質酮（CORT）水平比較Table 2 Comparison of rat serum interleukin（IL）-1β，brain-derived neurotrophic factor（BDNF）and corticosterone（CORT）levels among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與西藥組比較

組別假手術組模型組金絲桃苷低劑量組金絲桃苷中劑量組金絲桃苷高劑量組西藥組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 10 IL-1β/（ng·mL-1）224.60±13.20 70.44±8.08①152.33±10.25①②③163.22±11.40①②③184.55±13.03①②194.58±17.05①②178.600＜0.001 BDNF/（pg·mL-1）2 965.14±254.11 1 123.20±36.55①1 744.20±120.35①②③2 104.33±211.47①②③2 455.80±196.56①②2 505.36±188.70①②128.310＜0.001 CORT/（pg·mL-1）55.63±7.04 114.80±10.39①95.44±8.52①②③80.14±7.79①②③60.15±6.53①②62.71±6.19①②87.660＜0.001

2.3 各組大鼠心室電生理結果比較表3結果顯示：各組大鼠遠離梗死區的VERP水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與假手術組比較，模型組梗死周邊區VERP升高，VFT降低（P＜0.05）；與模型組比較，金絲桃苷低、中、高劑量組和西藥組梗死周邊區VERP降低，VFT升高（P＜0.05），且中藥組呈劑量依賴性；與西藥組比較，金絲桃苷高劑量組上述指標差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠心室有效不應期（VERP）、心室顫動閾值（VFT）比較Table 3 Comparison of ventricular effective refractory period（VERP）and ventricular fibrillation threshold（VFT）of rats among various groups （±s）

表3 各組大鼠心室有效不應期（VERP）、心室顫動閾值（VFT）比較Table 3 Comparison of ventricular effective refractory period（VERP）and ventricular fibrillation threshold（VFT）of rats among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與西藥組比較

組別假手術組模型組金絲桃苷低劑量組金絲桃苷中劑量組金絲桃苷高劑量組西藥組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 10梗死周邊區VERP/ms 53.02±2.88 71.25±5.35①66.25±3.04①②③60.18±2.69①②③56.88±2.80①②57.30±3.11①②38.490＜0.001遠離梗死區VERP/ms 50.33±2.20 52.39±2.84 52.36±2.54 51.27±2.33 51.58±2.60 52.17±2.53 1.014 0.418 VFT/V 13.28±1.68 7.45±1.64①8.25±1.80①②③9.63±1.77①②③10.55±1.73①②9.89±2.13①②12.750＜0.001

2.4 各組大鼠腦、心肌組織形態比較圖1結果顯示：假手術組大鼠腦組織海馬區域結構完整，細胞排列整齊、層次清晰，神經細胞核形態正常；模型組大鼠海馬區域結構破壞，神經細胞出現萎縮及核固；金絲桃苷低、中、高劑量組和西藥組大鼠腦組織海馬區結構逐漸趨于完整，神經細胞排列較整齊及層次較豐富，較模型組均明顯改善；西藥組與金絲桃苷高劑量組腦組織海馬區結構改善程度相似。

圖1 各組大鼠腦海馬區組織形態比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the histomorphological features of the hippocampal region of the rat brain among various groups（by HE staining，×200）

圖2結果顯示：假手術組大鼠心肌組織排列整齊，結構完整，無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠心肌組織結構紊亂，心肌細胞數目減少，出現大量肌絲溶解及炎癥細胞浸潤；與模型組比較，金絲桃苷低、中、高劑量組和西藥組心肌組織結構紊亂得到有效改善，心肌細胞數目增多，炎癥細胞浸潤逐漸減少。

圖2 各組大鼠心肌組織形態比較（HE染色，×200）Figure 2 Comparison of rat myocardial histomorphological features among various groups（by HE staining，×200）

2.5 各組大鼠心肌組織中NMDAR1、Kv4.2蛋白表達水平比較表4、圖3結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中NMDAR1蛋白表達水平升高，Kv4.2蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，金絲桃苷低、中、高劑量組和西藥組NMDAR1蛋白表達水平降低，Kv4.2蛋白表達水平升高（P＜0.05），且中藥組呈劑量依賴性；與西藥組比較，金絲桃苷高劑量組上述指標差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠心肌組織NMDAR1（A）、Kv4.2（B）蛋白的Western Blot電泳圖Figure 3 Western Blot electrophoretogram of NMDAR1（A）and Kv4.2（B）proteins in rat myocardial tissue in various groups

表4 各組大鼠心肌組織中NMDAR1及Kv4.2蛋白表達水平比較Table 4 Comparison of protein expression levels of NMDAR1 and Kv4.2 in rat myocardial tissue among various groups（±s）

表4 各組大鼠心肌組織中NMDAR1及Kv4.2蛋白表達水平比較Table 4 Comparison of protein expression levels of NMDAR1 and Kv4.2 in rat myocardial tissue among various groups（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與西藥組比較

組別假手術組模型組金絲桃苷低劑量組金絲桃苷中劑量組金絲桃苷高劑量組西藥組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 10 NMDAR1蛋白相對表達量1.20±0.20 3.36±0.71①2.81±0.62①②③2.28±0.46①②③1.69±0.44①②1.71±0.50①②24.400＜0.001 Kv4.2蛋白相對表達量1.55±0.42 0.47±0.20①0.66±0.26①②③0.80±0.24①②③1.19±0.18①②1.15±0.20①②22.670＜0.001

3 討論

本研究構建了心肌梗死后抑郁大鼠模型，造模過程中大鼠對外界聲源表現出由興奮狀態逐漸轉為抑郁狀態，可見目光呆滯、精神萎靡等，證實心肌梗死后抑郁大鼠缺乏活力，呈現少神狀態，這與“心藏神”功能失司密切相關[17]。

本研究HE染色結果顯示，模型組大鼠腦組織海馬結構破壞，神經細胞出現萎縮及核固，心肌組織結構紊亂，心肌細胞數目減少，出現大量肌絲溶解及炎癥細胞浸潤，而金絲桃苷組大鼠腦組織及心肌組織病理形態較模型組好轉，表明金絲桃苷可修復心腦組織病理損傷。腦組織和心肌組織出現不同程度的病理形態改變，則是“心藏神”功能受到損害后出現的病理變化。

IL-1β能夠增加非快速動眼，敲除后該效應消失、睡眠減少，提示IL-1β在調節生理性睡眠中起重要作用[18]。BDNF有調節睡眠的作用，上調其表達可增加睡眠慢波活性，縮短睡眠潛伏期[19]。CORT是一種由下丘腦-垂體-腎上腺素軸分泌的產物，其表達升高可增加血清中睡眠-覺醒因子進而導致睡眠障礙。本研究結果顯示，模型組大鼠較假手術組睡眠潛伏期延長、睡眠時間縮短，血清中IL-1β、BDNF含量減少，CORT含量增加；而與模型組比較，金絲桃苷組大鼠睡眠潛伏期縮短、睡眠時間延長，血清中IL-1β、BDNF含量增加，CORT含量減少。表明金絲桃苷能夠提高心肌梗死后抑郁大鼠的睡眠質量。

相關研究證實，心肌梗死后抑郁與異常的心室電生理異常相關[20-22]。本研究心肌電生理研究結果顯示，模型組大鼠梗死周邊區的VERP顯著增加，VTF降低，表明心肌梗死后抑郁大鼠交感神經活性、心室電不穩定性增加；金絲桃苷組大鼠心肌梗死周邊區VERP降低、VFT升高，表明金絲桃苷能夠改善心肌梗死后抑郁大鼠的心肌電生理異常。

N-甲基-D-天門冬氨酸受體（NMDAR）是一類離子型谷氨酸受體，其功能主要參與發育過程中神經回路的細化及觸發多種形式的突觸可塑性，NMDAR在抑郁癥患者中呈高表達[23]。NMDAR1是NMDA受體亞基之一，其異常激活能夠介導神經突觸損傷，降低神經突觸關聯，能夠影響神經元之間的信號傳遞，進而增加鈣離子大量內流、降低Kv4.2表達，可導致Ito電流密度降低、增加復極時間[24]。Lin等[25]研究表明，抑郁大鼠心肌細胞中NMDAR1表達顯著升高，其過度表達可增加心律失常等疾病發生。Kv4.2是重要的Ito電流離子通道蛋白，其表達降低時心臟電生理異常[26-27]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中NMDAR1表達升高，Kv4.2表達降低，而與模型組比較，金絲桃苷組大鼠心肌組織中NMDAR1表達降低，Kv4.2表達升高，表明金絲桃苷可阻斷心肌梗死后抑郁大鼠心肌NMDAR1表達，促進Kv4.2表達。

綜上所述，基于“心藏神”，本研究應用金絲桃苷治療心肌梗死后抑郁大鼠，發現金絲桃苷能夠改善心肌梗死后抑郁大鼠的心電不穩定性，改善睡眠質量，且其機制可能與增加血清中IL-1β、BDNF含量，減少CORT含量，抑制心肌組織NMDAR1表達及促進Kv4.2表達有關。

本研究存在一定的不足之處，今后有待加強心藏神和金絲桃苷治療心肌梗死后抑郁之間進一步聯結的研究，以期更好地為心肌梗死后抑郁提供治療方案。