苦參素對青光眼模型大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制

宋影慧，李文燾，賀琳，李洋，李艷，李曉鵬

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院眼科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.鄭州市第二人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

青光眼是一組以視乳頭改變伴隨視敏度下降，極易視野缺失為特征的視神經(jīng)退行性疾病，是僅次于白內(nèi)障的全球第二大致盲眼病[1-2]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells，RGCs）的進(jìn)行性丟失及軸突數(shù)目的減少是青光眼的主要病因[3-4]。因此，尋找新的安全有效的藥物以減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的丟失，對恢復(fù)青光眼患者視力至關(guān)重要。苦參素（matrine）主要從豆科植物苦參、苦豆子及廣豆根中提取，其中，氧化苦參堿成分含量在98%以上[5]。苦參素具有多種藥理學(xué)作用，如抗病毒、抗炎、抗纖維化、抑制腫瘤細(xì)胞等[6-7]。既往相關(guān)眼科研究表明：苦參素對實驗性自身免疫性視神經(jīng)炎模型大鼠的視神經(jīng)具有保護(hù)作用[8]；苦參素對長春新堿耐藥的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有促凋亡作用[9]；苦參堿眼液可降低實驗性葡萄膜炎家兔房水中炎癥因子水平，減輕炎性反應(yīng)[10]。基于苦參素在眼科治療方面的潛力，本研究建立青光眼大鼠模型，觀察苦參素對其視神經(jīng)保護(hù)的作用及機(jī)制，旨在為青光眼的臨床治療提供更多的藥物選擇，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40只SPF級健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量220~250 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0011。購入后委托華蘭生物工程股份有限公司飼養(yǎng)[許可證號：SYXK（豫）2017-0003]。保持環(huán)境通風(fēng)、溫度23~25℃，相對濕度50%~70%，明暗12 h/12 h交替。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，使用眼壓計測量眼壓，40只大鼠眼壓均正常。

1.2 藥物、試劑與儀器苦參素（成都曼思特生物科技有限公司，批號：A0095）；鹽酸法舒地爾注射液（Fasudil，天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號：19031601）；注射用鹽酸丁卡因（江蘇九旭藥業(yè)有限公司，批號：201223）；諾氟沙星滴眼液（安徽省雙科藥業(yè)有限公司，批號：210206）。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；兔抗大鼠Brn3a、Tau、突觸素（synaptophysin）等抗體（美國Invitrogen公司）；兔抗大鼠磷酸化肌球蛋白輕鏈（p-MLC）、磷酸化肌球蛋白輕鏈磷酸酶（p-MLCP）、磷酸化LIM激酶（p-LIMK）、Rho激酶（ROCK）1和ROCK2等抗體（美國Invitrogen公司）；山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）（英國Abcam公司）。Tope-open AVIA型眼壓計（美國Rei-chert公司）；裂隙燈（蘇州六六科技有限公司）；532-二極管激光（美國Alcon公司）；NIB910FL型熒光顯微鏡（廣州市明慧科技有限公司）；Fisher Biotech電泳儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 分組與建模將40只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、法舒地爾組和苦參素組，每組各10只。除正常組外，其余各組大鼠采用532-二極管激光光凝法[11]進(jìn)行造模。方法：麻醉固定大鼠，雙眼使用注射用鹽酸丁卡因進(jìn)行表面麻醉，以左眼作為實驗眼，右眼作為對照眼。將大鼠頭部置于裂隙燈顯微鏡頭架處，以532-二極管激光對左眼行靜脈血管光凝（包括角膜緣小梁網(wǎng)和角膜緣顳側(cè)及顳上、顳下3條鞏膜淺層靜脈），之后使用諾氟沙星滴眼液滴眼。隔日在裂隙燈下觀察結(jié)膜充血及水腫情況，若左眼眼壓高于右眼10 mmHg，則表示造模成功[12]。

1.4 給藥自模型制備當(dāng)日起即給藥。按照藥理試驗中動物與人體間的等效劑量換算公式[13]計算，法舒地爾組大鼠腹腔注射法舒地爾150 mg/kg，每日1次；苦參素組大鼠腹腔注射50 mg/kg苦參素[14]（生理鹽水溶解），每日1次；模型組注射等體積生理鹽水，每日1次。連續(xù)注射8 d。正常組大鼠不做處理。實驗期間，所有大鼠均存活。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 標(biāo)本采集建模后第8天，從每組中隨機(jī)選取5只大鼠，摘取眼球置于10%多聚甲醛中固定24 h，去除眼前節(jié)組織，取出晶體。每只眼球作為一個標(biāo)本，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，行視網(wǎng)膜矢狀面切片，厚度5 μm，用于HE染色和免疫熒光染色實驗。每組隨機(jī)另取5只大鼠，摘除眼球后，顯微鏡下去掉眼前節(jié)，取出晶體，剝離視網(wǎng)膜，將視網(wǎng)膜置于凍存管中，-80℃保存，用于蛋白免疫印跡（Western Blot）實驗。

1.5.2 HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜病理學(xué)改變將視網(wǎng)膜石蠟切片行常規(guī)HE染色，倒置顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜的組織結(jié)構(gòu)，采用圖像分析系統(tǒng)采集圖像，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0分析系統(tǒng)測定大鼠視網(wǎng)膜厚度。每張切片隨機(jī)選取5個測試點(diǎn)，取平均值。

1.5.3 免疫熒光染色法檢測大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)Brn3a及Tau、突觸素蛋白表達(dá)將視網(wǎng)膜石蠟切片脫蠟；PBS洗滌，檸檬酸抗原修復(fù)10 min后，自然冷卻；PBS洗滌，室溫下用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶20 min；PBS洗滌，每張切片加50 μL山羊血清，常溫下封閉內(nèi)源性生物素20 min；每張切片加相應(yīng)一抗Brn3a（1∶1 000稀釋）、Tau（1∶1 000稀釋）、突觸素（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜；PBS洗滌，加二抗（1∶2 000稀釋），37℃反應(yīng)2 h；PBS洗滌，脫水，封片。熒光顯微鏡下采集圖片，Image-Pro Plus 6.0定量分析各目的蛋白的熒光強(qiáng)度。計數(shù)Brn3a陽性標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

1.5.4 Western Blot法檢測大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)p-MLCP、p-MLC、p-LIMK、ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)取大鼠視網(wǎng)膜組織標(biāo)本，常規(guī)裂解方法提取細(xì)胞質(zhì)蛋白，按細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒說明書提取核蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒說明書檢測蛋白濃度。取上清液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用0.5%脫脂乳粉室溫封閉1 h，充分洗滌后分別加入p-MLCP（1∶1 000）、p-MLC（1∶1 000）、p-LIMK（1∶500）、ROCK1（1∶1 000）和ROCK2（1∶1 000）等一抗稀釋液，4℃孵育過夜。二抗（1∶5 000）稀釋液常溫孵育30 min，電化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色曝光，應(yīng)用ImageJ軟件分析蛋白灰度。以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。每組實驗獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間資料經(jīng)Levene檢驗證實方差齊性。多組間各指標(biāo)總體差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜病理形態(tài)比較圖1結(jié)果顯示：正常組大鼠視網(wǎng)膜各層排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核邊界清晰；模型組大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)水腫，視網(wǎng)膜厚度減小，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少，內(nèi)核層變薄，細(xì)胞排列疏松不規(guī)則，部分細(xì)胞核出現(xiàn)溶解或破碎樣；法舒地爾組和苦參素組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞異常程度較模型組減輕，視網(wǎng)膜厚度較模型組增加，與正常組無明顯差異。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜病理學(xué)形態(tài)比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of rat retinal pathological features among various groups（by HE staining，×200）

表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜厚度降低（P＜0.05）；與模型組比較，法舒地爾組和苦參素組大鼠視網(wǎng)膜厚度增加（P＜0.05），且與正常組無明顯差異（P＞0.05）；法舒地爾組與苦參素組視網(wǎng)膜厚度無明顯差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜厚度比較Table 1 Comparison of rat retinal thickness among various groups（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組法舒地爾組苦參素組F值P值鼠數(shù)/只5 5 5 5視網(wǎng)膜厚度/μm 154.21±6.55 74.02±4.13①135.50±3.34②130.61±5.00②13.054 0.000

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較圖2、表2結(jié)果顯示：模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；法舒地爾組和苦參素組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；法舒地爾組與苦參素組間視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量無明顯差異（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠Brn3a陽性標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布情況（免疫熒光染色，×200，標(biāo)尺=100 μm）Figure 2 Distribution of rat retinal ganglion cells（RGCs）positively labelled with Brn3a in various groups（by immunofluorescence staining，×200，scale bar=100 μm）

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較Table 2 Comparison of number of rat RGCs among various groups （±s）

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較Table 2 Comparison of number of rat RGCs among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組法舒地爾組苦參素組F值P值鼠數(shù)/只5 5 5 5視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量/個40.12±3.01 15.31±2.30①34.22±4.11②30.45±2.64②9.677 0.000

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜Tau和突觸素蛋白表達(dá)比較圖3、圖4、表3結(jié)果顯示：模型組大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)Tau和突觸素蛋白表達(dá)水平低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；法舒地爾組和苦參素組大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)Tau和突觸素蛋白表達(dá)水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；法舒地爾組與苦參素組間Tau和突觸素蛋白表達(dá)水平無明顯差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜Tau、突觸素蛋白表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of the protein expression levels of Tau and synaptophysin in rat retina among various groups （±s）

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜Tau、突觸素蛋白表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of the protein expression levels of Tau and synaptophysin in rat retina among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組法舒地爾組苦參素組F值P值鼠數(shù)/只5 5 5 5 Tau熒光強(qiáng)度61.02±3.24 15.63±2.14①46.94±3.06②42.00±1.55②10.840 0.000突觸素?zé)晒鈴?qiáng)度56.97±6.36 12.53±2.01①41.61±3.65②45.89±3.22②8.655 0.000

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜Tau的免疫熒光染色結(jié)果（×400，標(biāo)尺=50 μm）Figure 3 Immunofluorescence staining results of retinal Tau in various groups of rats（×400，bar=50 μm）

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜突觸素的免疫熒光染色結(jié)果（×400，標(biāo)尺=50 μm）Figure 4 Immunofluorescence staining results of retinal synaptophysin in various groups of rats（×400，bar=50 μm）

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜p-LIMK、p-MLC和p-MLCP蛋白表達(dá)比較圖5、表4結(jié)果顯示：模型組大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)p-LIMK、p-MLC和p-MLCP蛋白表達(dá)水平均高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；法舒地爾組和苦參素組大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)p-LIMK、p-MLC和p-MLCP蛋白表達(dá)水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；法舒地爾組和苦參素組間p-LIMK、p-MLC和p-MLCP蛋白表達(dá)水平無明顯差異（P＞0.05）。

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜p-LIMK、p-MLC和p-MLCP蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of the protein expression levels of p-LIMK，p-MLC and p-MLCP in rat retina among various groups（±s）

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜p-LIMK、p-MLC和p-MLCP蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of the protein expression levels of p-LIMK，p-MLC and p-MLCP in rat retina among various groups（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組法舒地爾組苦參素組F值P值鼠數(shù)/只5 5 5 5 p-LIMK蛋白相對表達(dá)量0.63±0.12 1.21±0.14①0.65±0.09②0.71±0.20②6.310 0.000 p-MLC蛋白相對表達(dá)量0.67±0.08 1.04±0.13①0.66±0.07②0.64±0.06②20.501 0.000 p-MLCP蛋白相對表達(dá)量0.65±0.13 0.92±0.12①0.68±0.07②0.63±0.09②18.347 0.000

圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜p-LIMK、p-MLC和p-MLCP的Western Blot電泳條帶圖Figure 5 Western Blot electrophoretic bands of p-LIMK，p-MLC and p-MLCP in rat retina in various groups

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)比較圖6、表5結(jié)果顯示：模型組大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；法舒地爾組和苦參素組大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而ROCK1蛋白表達(dá)水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；法舒地爾組與苦參素組間ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)水平無明顯差異（P＞0.05）。

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of the protein expression levels of ROCK1 and ROCK2 in rat retina among various groups （±s）

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of the protein expression levels of ROCK1 and ROCK2 in rat retina among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組法舒地爾組苦參素組F值P值鼠數(shù)/只5 5 5 5 ROCK1蛋白相對表達(dá)量0.54±0.09 0.91±0.13①0.76±0.10①②0.71±0.08①②10.688 0.000 ROCK2蛋白相對表達(dá)量0.67±0.11 1.22±0.15①0.72±0.11②0.78±0.12②9.537 0.000

圖6 各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)ROCK1、ROCK2的Western Blot電泳條帶圖Figure 6 Western Blot electrophoretic bands of ROCK1 and ROCK2 in rat retina in various groups

3 討論

青光眼與視神經(jīng)廣泛性病變、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量凋亡及其軸突變性有關(guān)，可導(dǎo)致慢性漸進(jìn)性視覺損傷。目前，臨床上對于青光眼的治療主要以降低眼壓為主，但由于青光眼視神經(jīng)病變最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的喪失，僅靠降低眼壓不能完全阻止視神經(jīng)的進(jìn)行性損傷，因此，開發(fā)青光眼的視神經(jīng)保護(hù)藥物，不僅能直接促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活，還能促進(jìn)軸突再生，從而使視神經(jīng)功能恢復(fù)，具有重要的研究意義。

有研究表明，眼部組織除晶狀體外，ROCK1和ROCK2均同時表達(dá)[15-16]。Rho蛋白是Rho基因編碼的信號肽，由200~300個氨基酸組成，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。Rho激酶（ROCK）為Rho的下游底物，ROCK有2種同工酶，分別為ROCK1和ROCK2。活化的ROCK可磷酸化其下游底物，包括MLC、MLCP及LIMK，導(dǎo)致生長錐的萎縮和軸突退縮，損傷視神經(jīng)細(xì)胞[17]。ROCK抑制劑能夠誘導(dǎo)視神經(jīng)損傷后軸突的生長和神經(jīng)再生。動物實驗證實，ROCK抑制劑組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突長度、密度及活動度較安慰劑組明顯增加[18]；體外實驗證實，ROCK抑制劑能保護(hù)經(jīng)硫酸軟骨素蛋白多糖處理的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，使神經(jīng)損傷程度降低，促進(jìn)細(xì)胞軸突生長[19]。推測ROCK通路相關(guān)蛋白可能是視神經(jīng)損傷后軸突的生長和神經(jīng)再生的重要靶點(diǎn)。

法舒地爾作為經(jīng)典的ROCK抑制劑，已被證實對青光眼視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有保護(hù)作用[20]，因此，本研究選用法舒地爾為對照藥物。苦參素來源廣泛，容易獲取，其安全性已得到證實[21]。Kan等[22]研究證實，苦參素能通過抑制Rho/ROCK信號通路的活性促進(jìn)多發(fā)性硬化癥動物模型中樞神經(jīng)細(xì)胞軸突再生。本研究觀察了苦參素對青光眼大鼠視網(wǎng)膜中ROCK通路相關(guān)分子表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，模型組大鼠視網(wǎng)膜p-LIMK、p-MLC和p-MLCP等ROCK通路下游主要目標(biāo)蛋白及ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)水平高于正常組（P＜0.05），法舒地爾組和苦參素組大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)上述各蛋白表達(dá)水平低于模型組（P＜0.05），法舒地爾組和苦參素組間各蛋白表達(dá)水平無明顯差異（P＞0.05）。表明苦參素可抑制青光眼大鼠視網(wǎng)膜ROCK及其下游分子表達(dá)，且其抑制作用與法舒地爾無明顯差異，提示苦參素可能是通過抑制ROCK通路活性促進(jìn)青光眼大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活及軸突的再生。

另外，Tau蛋白是神經(jīng)細(xì)胞中的主要微管相關(guān)蛋白，對神經(jīng)細(xì)胞骨架的穩(wěn)定起重要作用[23]。突觸素蛋白在視神經(jīng)突觸的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，增強(qiáng)突觸素的表達(dá)可促進(jìn)軸突的再生及神經(jīng)功能的恢復(fù)[24]。Tau和突觸素表達(dá)強(qiáng)度可表示青光眼大鼠視神經(jīng)突觸的再生狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，苦參素可提高青光眼大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量，上調(diào)視網(wǎng)膜Tau和突觸素蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步證明了苦參素可促進(jìn)青光眼大鼠視神經(jīng)軸突的再生。

綜上所述，苦參素對青光眼模型大鼠視神經(jīng)具有保護(hù)作用，可促進(jìn)青光眼大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活和軸突的生長，其作用機(jī)制可能與抑制ROCK的活性有關(guān)。