中泰南五味子轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析

李靜宇，徐友陽，蔡時可，王繼華

（1.廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點實驗室，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，廣東 廣州 510640；2.廣東省道地南藥資源保護(hù)與利用工程中心，廣東 廣州 510640；3.廣東清遠(yuǎn)和記黃埔有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 526070）

中泰南五味子（Kadsura ananosmaKerr）為五味子科南五味子屬攀緣植物，屬于離蕊南五味子亞屬。南五味子，味酸甘、性溫，歸肺、心、腎經(jīng)，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效，用于治療久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內(nèi)熱消渴、心悸失眠[1-3]。最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品[4]。

對中泰南五味子化學(xué)成分的研究發(fā)現(xiàn)，其含有較多的木脂素類和三萜類成分。木脂素類成分主要為聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素類化合物anano lignin A-N，而聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素是南五味子屬和五味子屬的特征性成分[5-6]。研究也發(fā)現(xiàn)不同種、藥用部分和產(chǎn)區(qū)的南五味子中木脂素含量和種類差異較大[7-9]。三萜類成分主要為羊毛甾脂烷型三萜類化合 物kadnanosic acid A-B、ananosic acid B-C、kadnanolactone A-I和R、schisanlactone F、micrandilactone B-C和wuweizidilactone H[8-9]。現(xiàn) 代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，南五味子除了具有抗炎、保肝作用外，還有一定的抗氧化、抗腫瘤和抗HIV活性作用[8，10-11]。但是，有關(guān)中泰南五味子木脂素類和三萜類等藥用成分生物合成分子機制的研究較為少見。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是植物功能基因組學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，能夠在整體水平上研究基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化趨勢及調(diào)控規(guī)律，挖掘關(guān)鍵基因，解析藥用活性成分合成代謝通路[12]。中泰南五味子基因組學(xué)研究相對薄弱，其轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究尚未見報道。因此，本研究開展中泰南五味子的轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析，以期為解析中泰南五味子藥用物質(zhì)合成關(guān)鍵基因的挖掘和調(diào)控以及開發(fā)分子標(biāo)記提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料中泰南五味子轉(zhuǎn)錄組測序材料在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所南藥資源圃采集，取樣時間為2021年5月，采集健壯植株的葉片和嫩莖，用錫箔紙包裹并迅速浸入液氮處理20 min，置于超-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 中泰南五味子RNA的提取中泰南五味子總RNA采用康為世紀(jì)的Total RNA Extractor試劑盒進(jìn)行提取，然后通過1%凝膠電泳檢測所提取RNA的完整性。采用Invitrogen Qubit?2.0熒光計及試劑盒（Fluorometer Life Tech Invitrogen，Q32886）對 總RNA進(jìn)行定量。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序與拼接組裝委托北京百邁客生物科技有限公司采用Illumina HiSeq 2500高通量測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。測序得到的原始數(shù)據(jù)，通過FastQC軟件進(jìn)行質(zhì)量評估和Trimmomatic質(zhì)量剪切，過濾掉接頭、低質(zhì)量的序列（reads長度小于35 nt的reads）、帶N堿基的序列、低質(zhì)堿基（Q值＜20），得到高質(zhì)量的clean data[13]。使用Trinity軟件對clean data進(jìn)行de novo拼接組裝，再采用RSeQC（RNA-seq data QC）軟件去除轉(zhuǎn)錄本中的冗余序列，得到Unigene[14]。

1.4 基因功能注釋將組裝長度在200 bp以上的中泰南五味子Unigene在保守域數(shù)據(jù)庫（Conserved Domain Database，CDD）、真 核 同 源 數(shù) 據(jù) 庫（Eukaryotic Orthologous Groups，KOG）、非冗余數(shù)據(jù)庫（Non-redundant Database，NR）、核酸序列數(shù)據(jù)庫（Nucleotide Sequence Database，Nt）、蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測數(shù)據(jù)庫（Protein Families Database of Alignments and Hidden Markov Models，PFAM）、Swissprot和TrEMBL等多個數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行功能注釋。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本與數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果和Transdecoder進(jìn)行編碼序列預(yù)測。根據(jù)Unigene與SwissProt、TrEMBL的注釋結(jié)果，分析得到基因本體論（Gene Ontology，GO）功能注釋信息，利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Database，KEGG）自 動 注 釋 服 務(wù) 器（KEGG Automatic Annotation Server，KAAS）得到KEGG注釋信息。

1.5 基因結(jié)構(gòu)分析對長度在1 000 bp以上的中泰南五味子Unigene使用微衛(wèi)星識別工具（Microisatellite Identification Tool，MISA）軟件鑒定簡單序列重復(fù)（SSR）位點，并利用Primer 3.0軟件（http://primer3.sourceforge.net/releases.php）設(shè)計相應(yīng)SSR引物[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序與de novo組裝中泰南五味子cDNA文庫的構(gòu)建由北京百邁客生物科技有限公司完成，并利用Illumina HiSeq 2500測序平臺測序。使用Trimmomatic對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，去掉含有帶接頭、低質(zhì)量的序列，共得到21 545 302 clean reads，總堿基數(shù)目為6 430 141 426 bp，GC含量為47.16%，Q30 bases ratio達(dá)到94.61%，表明文庫構(gòu)建質(zhì)量良好，測序得到的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。使用Trinity將clean reads進(jìn)行de novo組裝成轉(zhuǎn)錄本，共得到68 573條轉(zhuǎn)錄本，總長86 867 930 bp，平均長度為1 267 bp，N50為1 769 bp，序列長度大于等于500 bp的有51 596條，占總序列數(shù)目的75.24%，序列長度在1 000 bp以上的有33 601條，占總數(shù)的49.00%。見表1。對Trinity拼裝得到的轉(zhuǎn)錄本去冗余，共獲得29 915條Unigene，總長30 888 944 bp，平均長度為1 033 bp，N50為1 554 bp，其中18 629條序列長度大于等于500 bp，占總序列數(shù)目的62.27%，序列長度在1 000 bp以上的有10 747條，占總數(shù)的35.93%。見表1、圖1。

表1 中泰南五味子轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果Table 1 Transcriptome sequencing results of Kadsura ananosma Kerr

圖1 中泰南五味子Unigene序列長度分布Figure 1 Length distribution of the unigene sequences of Kadsura ananosma Kerr

2.2 Unigene功能注釋見表2。中泰南五味子組裝后的Unigene序列與CDD、KOG、COG、NR、Nt、PFAM、SwissProt、TrEMBL等多個數(shù)據(jù)庫比對，共有22 359條Unigene在至少1個數(shù)據(jù)庫中獲得功能注釋。其中，NR數(shù)據(jù)庫中注釋到的Unigene數(shù)目最多（21 231條），占總Unigene的95.0%，其次為TrEMBL數(shù)據(jù)庫，注釋到的Unigene為21 099條，占94.4%。COG數(shù)據(jù)庫中注釋到的Unigene數(shù)目最少（5 863條，26.2%）。通過與NR庫的比對，獲得中泰南五味子Unigene序列與近緣種屬的近似情況并獲得同源序列的功能信息，共有21 231條Unigene獲得注釋。匹配較多的物種主要有Nelumbo nucifera，Cinnamomum micranthum，Macleaya cordata，Amborella trichopoda和Nymphaea colorata，分 別占16.88%，15.65%，9.07%，8.78%和3.40%。可見中泰南五味子與荷花（Nelumbo nucifera）的序列相似度最高。見圖2。

圖2 非冗余數(shù)據(jù)庫（NR）數(shù)據(jù)庫的同源物種分類Figure 2 Classification of homologous species in the NR database

表2 中泰南五味子Unigene的功能注釋Table 2 Functional annotation of unigenes of Kadsura ananosma kerr

2.3 KEGG功能注釋根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果，共有14 284條Unigene涉及五大類功能，包括代謝、遺傳信息過程、細(xì)胞過程、環(huán)境信息過程和有機系統(tǒng)。Unigene共涉及137條代謝通路。見圖3。在有機系統(tǒng)中，涉及植物-病原相互關(guān)系通路的Unigene最多有497條，其次為植物晝夜節(jié)律通路共涉及90條Unigene；在代謝中，涉及碳代謝、淀粉和蔗糖代謝和氨基酸生物合成的Unigene最多，分別包含368、309和287個基因；在遺傳信息過程中，注釋到Unigene最多的3個代謝過程為核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工和剪接體，分別包含343、298和277個基因；在環(huán)境信息響應(yīng)過程中，涉及到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號通路和ABC轉(zhuǎn)運通路的基因最多，分別包含425、325和120條Unigene；在細(xì)胞過程中，內(nèi)吞作用、吞噬體和過氧化物酶體通路中包含基因數(shù)目最多，分別包含249、117和114個基因。南五味子中包含三萜、木脂素、揮發(fā)油和多糖等多種功能活性成分。本研究鑒定到181條Unigene涉及苯丙烷類生物合成，38條Unigene涉及倍半萜類和三萜類生物合成，24條Unigene涉及二萜類生物合成，17條Unigene涉及單萜類生物合成，75條Unigene涉及萜類骨架生物合成，59條Unigene涉及泛醌和其他萜-醌生物合成通路。這些與功能性物質(zhì)合成相關(guān)Unigene的鑒定，為進(jìn)一步解析中泰南五味子藥用成分的生物合成提供了可能。

圖3 中泰南五味子Unigene的京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能分類Figure 3 Functional classification of KEGG from the Kadsura ananosma Kerr unigenes

2.4 GO功能注釋GO數(shù)據(jù)庫是全面描述生物體中基因及其產(chǎn)物屬性的分類系統(tǒng)，主要分為生物過 程（Biological process）、細(xì) 胞 組 分（Cellular component）及分子功能（Molecular funtion）三大類。根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果，共有18 084條中泰南五味子Unigene注釋成功，其中，生物過程中包含100 068條Unigene，細(xì)胞組分中包含46 406條Unigene，分子功能中包含39 806條Unigene。見圖4。這些Unigene總共被劃分為43個功能分類，其中：分子功能中的ATP結(jié)合注釋到的Unigene最多，共有2 259條；細(xì)胞組分中的膜的組成成分和細(xì)胞組分GO條目中注釋到的Unigene較多，分別為4 261和2 237條；生物過程大類中的生物過程GO條目最多，包含2 262條Unigene。這些通路與中泰南五味子的生長發(fā)育和藥用成分的合成密切相關(guān)。

圖4 中泰南五味子Unigene的基因本體論（GO）功能分類Figure 4 GO functional classification of Kadsura ananosma Kerr unigenes

2.5 編碼序列（CDS）分析對中泰南五味子轉(zhuǎn)錄組所有Unigene的CDS序列進(jìn)行預(yù)測，通過Blast比對共獲得CDS序列9 843個，其中長度大于200 bp的占66.26%。見圖5。

圖5 中泰南五味子Unigene的編碼序列（CDS）長度分布Figure 5 CDS length distribution of assembled unigenes of Kadsura ananosma Kerr

2.6 SSR分析采用MISA對組裝長度為1 000 bp以上的10 747條Unigene進(jìn)行SSR檢測，并對SSR的類型和密度進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果表明，在3 560條Unigene中共鑒定到6 363個SSR位點。其中，2 127條Unigene中檢測到2個及以上的SSR位點，632條Unigene中檢測到3個復(fù)雜重復(fù)類型的SSR位點。最豐富的重復(fù)類型是雙堿基重復(fù)，共檢測到1 495個位點，其次為單堿基重復(fù)1 433個、三堿基重復(fù)605個、四堿基重復(fù)16個、六堿基重復(fù)5個和五堿基重復(fù)6個位點，見圖6。

圖6 中泰南五味子Unigene的簡單序列重復(fù)（SSR）位點密度分布Figure 6 Density distribution of SSR loci of Kadsura ananosma Kerr unigenes

3 討論

轉(zhuǎn)錄組分析可以為系統(tǒng)解析藥用植物代謝途徑提供支撐。植物體內(nèi)存在復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，植物細(xì)胞中幾乎所有活動都被基因網(wǎng)絡(luò)所控制[16]。依托大數(shù)據(jù)分析能力的進(jìn)步，通過對高通量測序數(shù)據(jù)構(gòu)建的基因及代謝網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫預(yù)測并挖掘新的生物合成網(wǎng)絡(luò)及途徑基因和分子標(biāo)記開發(fā)上的應(yīng)用越來越廣泛[12]。本研究基于Illumina HiSeq 2500高通量測序平臺對中泰南五味子葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得6.43 Gb Clean Data，經(jīng)過mRNA片段化隨機性檢驗、插入片段長度檢驗、轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)飽和度檢驗等轉(zhuǎn)錄組測序文庫質(zhì)量評估，其中Q30 bases ratio達(dá)到94.61%，GC含量為47.16%，結(jié)果表明，中泰南五味子轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可信度高。通過de novo組裝，共獲得68 573條轉(zhuǎn)錄本，其中序列長度大于等于500 bp的有51 596條，共獲得29 915條Unigene，平均長度為1 033 bp，N50為1 554 bp，表明中泰南五味子轉(zhuǎn)錄組序列組裝質(zhì)量較高。對Unigene進(jìn)行功能注釋發(fā)現(xiàn)22 359條Unigene至少在一個公共數(shù)據(jù)庫中獲得注釋。其與荷花（Nelumbo nucifera）和沉水樟（Cinnamomum micranthum）親緣關(guān)系最為接近。通過KEGG功能注釋，共鑒定到181條Unigene涉及苯丙烷類生物合成，38條Unigene涉及倍半萜類和三萜類生物合成，24條Unigene涉及二萜類生物合成，17條Unigene涉及單萜類生物合成，75條Unigene涉及萜類骨架生物合成，59條Unigene涉及泛醌和其他萜-醌生物合成通路。本研究結(jié)果為解析中泰南五味子中藥用活性成分木脂素、三萜等的合成通路提供了基礎(chǔ)[17-18]。

SSR分子標(biāo)記引物的開發(fā)是進(jìn)行SSR分子標(biāo)記研究的前提條件。利用轉(zhuǎn)錄組結(jié)果鑒定EST-SSR比非編碼序列更加容易，提高了遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助育種研究的準(zhǔn)確性。隨著技術(shù)的發(fā)展，開展中藥材的分子鑒定研究和應(yīng)用十分必要[19]。目前，SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于甘草、鐵皮石斛、枸杞等中藥材的遺傳圖譜構(gòu)建[20-21]。本研究共檢測到6 363個SSR位點，其中雙堿基重復(fù)最多，共檢測到1 495個位點，與既往研究的中藥溪黃草、肇實和黃金艾蒿類似[22-24]。本研究結(jié)果為中泰南五味子SSR分子標(biāo)記的開發(fā)和解析中泰南五味子藥用活性成分合成通路及分子生物學(xué)研究提供了基礎(chǔ)的遺傳信息，也有利于其保護(hù)和利用。