高敏HBV-DNA檢測在低病毒血癥患者抗病毒治療監測中的應用研究

龍黎 張卿 熊晏 羅新華 邵和軍

(貴州省人民醫院感染科，貴州 貴陽 550002)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一項全球性公共衛生問題，但不同地區的流行強度差異很大。據估計，目前我國一般人群HBsAg流行率為5%～6%，慢性乙型病毒性肝炎患者約2 000～3 000萬例[1]。HBV慢性感染現已成為我國肝硬化和原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最主要的原因[2]。核苷(酸)類抗病毒藥物通過抑制乙肝病毒復制，改善肝臟炎癥，能有效逆轉肝硬化并降低HCC的發生率。在抗病毒治療適應癥選擇及療效判斷中，HBV-DNA檢測扮演重要角色。目前，國內各醫療單位常用的HBV-DNA定量檢測方法的靈敏度在200～1000IU/mL之間，然而，隨著臨床研究的深入，發現許多經過長期抗病毒治療的患者，HBV-DNA水平仍處于低水平復制狀態(常常低于現有檢測水平下限)，而這些患者肝硬化進展及HCC發生風險明顯大于取得持續病毒學應答的患者[3]。因此，現有的HBV-DNA檢測精度已不能滿足臨床對慢乙肝患者病情評估的需要。我們的研究收集了采用普通熒光定量PCR檢測HBV-DNA水平低于檢測下限(<200 IU/mL)的慢乙肝患者血清標本，采用高靈敏度熒光定量PCR試劑再次檢測HBV-DNA水平(檢測下限<10 IU/mL)，并將HBV-DNA水平與HBeAg定量結果以及肝硬度值進行對照分析，以此探討高敏HBV-DNA檢測在慢乙肝低病毒血癥患者抗病毒治療監測中的應用及意義。報告如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2019年12月至2021年6月于貴州省人民醫院感染科門診或住院治療的共175例慢乙肝患者的臨床資料。其中，男128例，女47例，年齡18～52歲，平均年齡(32±9)歲。入選標準：年齡為 18 周歲及以上，性別不限；HBsAg陽性至少6個月；接受抗病毒治療且應用國產試劑檢測HBV-DNA均低于檢測下限(<200IU/mL)。排除標準：合并其他肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的患者；合并自身免疫性疾病的患者；肝硬化患者；原發性肝癌患者；妊娠或哺乳期患者；合并其他嚴重的慢性疾病患者；目前正在參與其它臨床試驗研究患者。所有患者均簽署了知情同意書。

1.2主要儀器與試劑 普通熒光定量PCR檢測試劑為國產實時熒光定量PCR試劑盒，應用Mx3000P型熒光定量PCR儀(美國安捷倫/Agilent Technologies)。高敏熒光定量PCR檢測試劑應用Abbott RealTime HBV Amplification Reagent Kit(美國雅培)。Cobas E602 電化學發光全自動免疫分析系統(瑞士羅氏)。乙肝兩對半定量試劑盒(瑞士羅氏)。肝硬度值由FibroScan 502 Touch(ECHOSENS)測量。

1.3方法 將普通熒光定量PCR檢測結果低于檢測下限(<200IU/mL)的175份血清標本采用高敏熒光定量PCR檢測試劑再次進行檢測，具體操作和結果判定參照試劑盒說明書進行。同時對所收集的血清標本進行HBeAg定量檢測。對所有患者進行肝硬度值測量。

2 結 果

2.1普通熒光定量PCR與高敏熒光定量PCR檢測慢乙肝患者HBV-DNA結果比較 175份采用普通 PCR 檢測結果為陰性的慢乙肝患者標本中，采用高敏PCR 試劑進行復查，根據血清HBV-DNA定量水平(IU/mL)，存在以下5種結果，即>200IU/mL共15例，占比8.5%，100～200IU/mL共17例，占比9.7%，10～100IU/mL共49例，占比28%，<10IU/mL共26例，占比14.9%，陰性68例，占比38.9%。

2.2慢乙肝患者血清HBV-DNA載量與血清HBeAg的關系 隨著血清HBV-DNA水平的增高，各組血清HBeAg陽性率和水平也存在升高的趨勢。其中，HBV-DNA陰性組血清 HBeAg定量水平顯著低于100～200IU/mL組和>200IU/mL組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 慢乙肝患者HBV-DNA載量與HBeAg狀況的關系

2.3慢乙肝患者血清HBV-DNA載量與肝臟硬度值的關系 HBV-DNA>200IU/mL組肝硬度值與HBV-DNA陰性組肝硬度值有明顯差異(P=0.023)，其余各組之間比較，差值均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 慢乙肝患者HBV-DNA載量與肝硬度值關系

3 討 論

通過分泌HBeAg等自身蛋白干擾抗病毒信號轉導途徑從而抑制非特異性免疫應答的強度以及HBV特異性T細胞的凋亡及耗竭是乙肝感染慢性化的重要機制[4]。HBV并不直接殺傷肝細胞，其引起的免疫應答是導致肝細胞損傷及炎癥壞死的主要機制，而炎癥壞死持續存在或反復出現是肝硬化甚至HCC發生發展的重要因素。隨著恩替卡韋、替諾福韋等一線抗病毒藥物可及性的提高，越來越多的患者得到了有效的抗病毒治療，從而降低了肝硬化和HCC的發生發展[5]。

HBV-DNA是HBV病毒學檢測的重要內容，用于評估HBV感染者病毒復制水平、抗病毒適應癥的選擇以及療效的判斷。HBV-DNA的檢測閾值直接影響了對抗病毒療效及停藥指導甚至患者預后的判斷。國內目前大部分醫療機構HBV-DNA常規檢測的靈敏度范圍已經越來越不能滿足臨床需求。從我們的實驗結果來看，經普通熒光定量PCR檢測低于下限(200IU/mL)的175份血清標本，通過高敏HBV-DNA檢測，發現僅有68份為陰性，提示仍有相當部分患者經過抗病毒治療后仍處于低病毒血癥狀態。目前，低病毒血癥的危害已經得到越來越多的認識。例如，韓國一項納入875名慢乙肝患者的回顧性研究中，經過長期恩替卡韋抗病毒治療后，仍有高達377名患者HBV-DNA處于低水平復制狀態，在這些HBV-DNA低水平復制狀態的慢乙肝感染者，尤其是肝硬化患者中，HCC的發生率明顯高于那些獲得持續病毒學應答的患者[6]。國內的研究也顯示持續的低病毒血癥是肝纖維化進展的獨立危險因素[3]。因此，高敏HBV-DNA的檢測對于精準把握乙肝抗病毒治療療效、準確判斷患者預后等顯得至關重要。

HBeAg是乙肝病毒核心顆粒中的一種可溶性蛋白，由HBV-DNA開放讀碼框前C區編碼。HBeAg陽性被認為是病毒復制活躍且具有較強傳染性的標志，HBeAg陰轉、抗-HBeAg的出現，標志著機體從免疫清除期進入免疫控制期。和HBV-DNA一樣，HBeAg水平也被認為是抗病毒治療過程中對核苷(酸)類似物治療反應進行預測的有效工具[7]。結合我們的研究結果也顯示了HBeAg與HBV-DNA定量水平總體上呈正相關趨勢。然而，在乙肝病毒感染過程中，在宿主免疫壓力下，可產生免疫逃避株，常見的如前C區G1896A點突變，這會導致HBeAg表達的終止，從而出現HBeAg陰性病毒血癥[8]，這與我們檢測結果中部分患者出現HBeAg陰性，但HBV-DNA仍然可檢出相符合。普通熒光定量PCR試劑一般采用S或C區等保守段基因進行單靶標擴增，因此，不可避免的存在定量值偏低甚至漏檢可能，而我們的研究結果也證實了這種情況，即普通PCR檢測低于其下限(<200IU/mL)的標本經高敏熒光定量PCR復檢，有約8.5%標本結果高于200IU/mL。因此，對這部分HBeAg陰性病毒血癥患者，高敏HBV-DNA檢測更能準確反應病毒復制狀態及評估抗病毒療效。

多數慢性乙肝感染所致肝纖維化及早期肝硬化并無特異性癥狀、體征，常規血液生化指標也可能無明顯異常，如果不進行肝臟組織病理學檢查則不易被及時發現。而肝臟瞬時彈性成像技術作為一種重要的肝纖維化無創診斷技術，已廣泛應用于臨床。為此，本文還對不同HBV-DNA水平組患者肝硬度值的差別進行了分析比較。HBV-DNA是反應病毒復制程度的標志，持續的病毒復制導致機體免疫應答，從而引起炎癥壞死的持續，因此，病毒載量也可在一定程度上反應慢性乙型肝炎患者肝組織的炎癥及纖維化程度，對評估患者病情有重要意義[9]。我們的觀察結果也顯示了HBV-DNA水平與肝硬度值總體上的正相關趨勢。同時，我們的結果還顯示普通熒光定量PCR陰性但高敏熒光定量PCR陽性的患者，其肝硬度值高于纖維化診斷界值，這部分患者可能面臨纖維化進展風險，但有待于臨床進一步密切觀察。同時，這也與目前報告的關于低病毒血癥患者纖維化進展風險相一致。

總之，通過我們的研究，反映了高敏熒光定量PCR在慢性乙型病毒性肝炎尤其是低病毒血癥患者病毒復制、肝臟炎癥進展監測中的價值，為慢乙肝患者抗病毒治療過程中精準的病情監測提供了有力的支撐。由于我們樣本例數偏少，還需要多中心、大樣本以及長期隨訪觀察進一步支持我們的論斷。同時，高敏熒光定量PCR在隱匿型乙肝、腫瘤患者放、化療后HBV再激活風險的評估等方面的應用值得我們進一步的探討。