益氣活血利水方對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

姚 萍, 陳光宇, 苗春華

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科, 四川 成都, 610032)

心力衰竭(HF)又稱心功能不全，是由各種心臟疾病導(dǎo)致的以體循環(huán)淤血為主要表現(xiàn)的疾病，也是多種心臟疾病發(fā)展的終末階段，患者病死率居高不下[1]。HF是心血管疾病患者的主要死因，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，已引起廣泛重視[2]。相關(guān)研究[3]顯示, HF患者心肌組織中肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶2a(SERCA2a)表達降低，從而影響心臟收縮與舒張功能，而SERCA2a表達上調(diào)后可增加鈣結(jié)合，并增加PKA信號通路調(diào)節(jié)的受磷蛋白(PLN)表達，從而提升鈣轉(zhuǎn)運能力。心室重構(gòu)是HF發(fā)生發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)，其機制比較復(fù)雜，細(xì)胞凋亡及基因蛋白再編碼均可增加HF的發(fā)病風(fēng)險。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞最大的細(xì)胞器，而HF是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白過度積累和促鈣穩(wěn)態(tài)失衡的重要原因，可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，促進心肌細(xì)胞凋亡。HF發(fā)生發(fā)展的過程與多種因子異常表達相關(guān)，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)活性增強可上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)表達，提高心肌纖維細(xì)胞活性，加快心室重構(gòu)，促進HF的發(fā)生發(fā)展[4]。目前，HF的治療方法以藥物干預(yù)為主，西藥可取得較好的臨床效果，但不良反應(yīng)較多，中醫(yī)藥對HF的確切療效亦已得到證實。益氣活血利水方由林謙教授根據(jù)中醫(yī)氣血理論并緊密結(jié)合病機所創(chuàng)，具有良好的抗HF作用[5]。本研究建立HF大鼠模型，觀察不同濃度益氣活血利水方溶液對心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡及TGF-β1、AngⅡ表達的影響，以期為HF治療藥物的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物為60只Sprague-Dawley(S-D)雄性大鼠，體質(zhì)量240～260 g, 鼠齡4～5周，購于廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心，動物許可證號SYXK(粵)2020-0016。在通風(fēng)且干凈的環(huán)境中飼養(yǎng)大鼠，每只籠子5只大鼠，溫度23 ℃左右，濕度50%左右，黑夜白晝交替循環(huán)，給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料自由進食，并給予干凈飲用水。所有實驗動物于實驗開始前適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周，動物實驗的實施嚴(yán)格遵照《實驗動物護理和使用指南》且遵守實驗動物福利與倫理原則，本研究方案獲得實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)并全程跟蹤。

1.2 藥物

① 益氣活血利水方: 生黃芪30 g、黨參15 g、丹參15 g、桃仁10g、紅花l0 g、桑白皮10 g、葶厲子15 g、豬苓15 g、澤蘭15 g。取200 mL水浸泡藥材20 min, 繼續(xù)加水400 mL, 大火煮沸小火煎煮40 min, 取汁200 mL, 濃縮成不同濃度藥汁，包括高濃度(3 mL含有8 g原藥材)、中濃度(3 mL含有4 g原藥材)和低濃度(3 mL含有2 g原藥材)藥汁。② 曲美他嗪(北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H20056425)。

1.3 主要試劑與儀器

多聚甲醛、乙醇(阿拉丁化學(xué)試劑有限公司); 0.9%生理鹽水(中國大冢制藥有限公司); 戊巴比妥鈉(上海上藥新亞，以注射用水稀釋為2%溶液); 兔抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)、半胱天冬酶-3(Caspase3)多克隆抗體(英國 Abcam公司); TGF-β1單克隆抗體(北京碧橙藍生物科技有限責(zé)任公司); 兔抗人AngⅡ單克隆抗體(上海萬疆生物技術(shù)有限公司); 石蠟切片機(德國萊卡); 臺式高速離心機(美國Bio-rad公司); 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司); AU5400自動生化分析儀(美國Beckman Coulter公司); 普通顯微鏡(日本Olympus公司); 蛋白電泳儀(北京六一儀器)。

1.4 HF大鼠模型建立

參考文獻[6]建立HF大鼠模型，建模前使用S80彩色多普勒超聲診斷儀對60只大鼠進行心臟檢查，確保心功能正常。采用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，連接小動物呼吸機，在3～4肋骨間分離皮膚并剪開心包后，采用6-0絲線結(jié)扎左側(cè)心耳及動脈圓錐正下方2 mm處，然后縫合皮膚，待大鼠自主呼吸后撤掉呼吸機，連續(xù)3 d注射40萬U青霉素。假手術(shù)組大鼠僅切口穿線，不結(jié)扎。4周后，對大鼠進行心電彩超檢查，以左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<45%作為建模成功。50只建模大鼠中，感染致死5只，共45只大鼠建模成功; 假手術(shù)組10只大鼠均未死亡。

1.5 分組與藥物處理

將未建立HF的10只假手術(shù)組大鼠設(shè)為Sham組，并將45只建模成功的大鼠按照隨機數(shù)字法分為HF組、低干預(yù)組、中干預(yù)組、高干預(yù)組和西藥組，每組9只。低干預(yù)組、中干預(yù)組、高干預(yù)組分別灌胃 2.6、5.2、10.4 g/(kg·d)益氣活血利水溶液，西藥組灌胃10.0 mg/(kg·d)曲美他嗪, Sham組、HF組分別灌胃等體積0.9%NaCl溶液，各組大鼠均每日灌胃1次，連續(xù)4周。

1.6 組織提取及蘇木精-伊紅(HE)染色

頸部脫臼處死小鼠，采集心臟組織，石蠟包埋，于10%甲醛溶液中固定過夜，自來水沖洗，浸泡于14%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中脫鈣，逐層脫水后石蠟包埋，切成4 μm切片備用。將組織切片于37 ℃復(fù)溫15 min, 二甲苯脫蠟后按照100%→95%→85%→75%乙醇進行逐層脫水，蘇木精染色10 min, 鹽酸(1%)處理，伊紅復(fù)染，100%→95%→85%→75%乙醇脫水，封片后觀察組織形態(tài)。

1.7 電鏡觀察

于解剖顯微鏡下分離心肌組織，采用4%戊二醛緩沖液固定6 h, 再用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5次，采用0.2 mol/L PBS與2%四氧化鋨固定液按照1∶1配制，然后用梯度酒精(30%→50%→70%→90%)固定10 min后脫水，浸透、包埋、聚合、超薄切片后以醋酸鈾染色15 min, 于電鏡下觀察。

1.8 心肌肌質(zhì)網(wǎng)鈣攝取功能檢測

提取心肌組織，采用離心機勻漿(1 600轉(zhuǎn)/min, 2 ℃離心10 min), 然后提取上清液，采用Bradford染料結(jié)合法檢測蛋白，以MgATP啟動肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子的攝取，囊泡外游離鈣離子濃度不變提示肌質(zhì)網(wǎng)攝取活動結(jié)束，根據(jù)囊泡外游離鈣離子與時間得出鈣離子攝取速率，用蛋白濃度進行校正。

1.9 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡情況

心肌組織于甲醛中固定4 h, 脫水，經(jīng)辣根過氧化酶(HRP)催化底物后生成深棕色沉淀物，采用蘇木精對細(xì)胞核染色后于顯微鏡下觀察深棕色沉淀物(每張切片隨機選取不交叉重復(fù)的5個視野)，顏色越深表示凋亡越多。凋亡率=凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞×100%。

1.10 免疫印跡法檢測心肌組織中蛋白表達情況

采用免疫印跡法檢測心肌組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase3)和鈣轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白[鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、蘭尼堿受體2(RyR2)、SERCA2a]表達情況。心肌組織加入1%裂解液，采用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量檢測，取蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉1.5 h, 然后分別加入Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、Caspase3(1∶500)、CaMKⅡ(1∶1 000)、RyR2(1∶1 000)、SERCA2a(1∶1 000)一抗，內(nèi)參為GAPDH(1∶2 000), 加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)過夜，搖勻，采用TBST緩沖液沖洗，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，試驗重復(fù)3次后取平均值。

1.11 免疫組織化學(xué)法檢測心肌組織中TGF-β1、AngⅡ蛋白陽性率

將心肌組織切片進行二甲苯脫蠟，逐級乙醇脫水，枸櫞酸鹽水修復(fù), PBS沖洗，加入磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)抗體, 4 ℃過夜后，加入山羊抗兔二抗孵育30 min, 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木精復(fù)染后逐級脫水，于光鏡下觀察，隨機選擇5個視野分析陽性細(xì)胞占比，計算蛋白陽性率。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果比較

Sham組心肌組織染色均勻，結(jié)構(gòu)清晰完整，橫紋整齊且分布規(guī)則，未見壞死溶解與炎癥細(xì)胞浸潤; HF組心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞水腫，橫紋模糊，且存在部分細(xì)胞體積縮小及細(xì)胞空泡現(xiàn)象; 低干預(yù)組、中干預(yù)組心肌組織染色不均勻，心肌毛細(xì)血管充血且部分水腫，但細(xì)胞橫紋結(jié)構(gòu)較清晰; 高干預(yù)組、西藥組心肌間質(zhì)毛細(xì)血管增多、充血，總體細(xì)胞損傷情況輕于低干預(yù)組、中干預(yù)組。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色圖(放大200倍)

2.2 各組大鼠心肌組織電鏡觀察結(jié)果比較

Sham組心肌細(xì)胞間具有整齊排列的線粒體，細(xì)胞核位于心肌細(xì)胞周圍，存在少量染色質(zhì)，分布在細(xì)胞核下，心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞無腫脹; HF組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，心肌纖維出現(xiàn)斷裂，線粒體代謝增多及基質(zhì)溶解、消失，細(xì)胞核出現(xiàn)溶解、消失; 低干預(yù)組、中干預(yù)組、高干預(yù)組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸清晰，其中高干預(yù)組心肌細(xì)胞排列情況與線粒體形態(tài)較好，低干預(yù)組、中干預(yù)組細(xì)胞核部分腫脹變性; 高干預(yù)組、西藥組細(xì)胞輕度腫脹，吞飲泡減少。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織電鏡觀察圖(放大10 000倍)

2.3 各組大鼠心肌肌質(zhì)網(wǎng)鈣攝取速率比較

Sham組、HF組、低干預(yù)組、中干預(yù)組、高干預(yù)組、西藥組大鼠心肌肌質(zhì)網(wǎng)鈣攝取速率分別為(19.63±5.63)、(10.25±4.11)、(13.70±5.12)、(14.08±4.80)、(16.91±5.03)、(16.65±5.10)μmol/(mg·min), 多組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.946,P=0.004)。進一步兩兩比較, Sham組大鼠心肌肌質(zhì)網(wǎng)鈣攝取速率分別高于另外5組，低干預(yù)組、中干預(yù)組、高干預(yù)組和西藥組均高于HF組，高干預(yù)組、西藥組均高于低干預(yù)組、中干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 低干預(yù)組心肌肌質(zhì)網(wǎng)鈣攝取速率與中干預(yù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 高干預(yù)組心肌肌質(zhì)網(wǎng)鈣攝取速率與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見圖3。

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較

Sham組、HF組、低干預(yù)組、中干預(yù)組、高干預(yù)組、西藥組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率分別為(7.52±2.01)%、(30.63±6.58)%、(19.14±5.03)%、(18.41±5.21)%、(13.61±3.65)%、(13.17±4.11)%，多組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.900,P<0.001)。進一步兩兩比較, HF組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率高于Sham組，低干預(yù)組、中干預(yù)組、高干預(yù)組和西藥組心肌細(xì)胞凋亡率均低于HF組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 低干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡率與中干預(yù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 高干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡率低于中干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 高干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡率與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見圖4。

與Sham組比較, ?P<0.05; 與HF組比較, #P<0.05; 與低干預(yù)組比較, △P<0.05; 與中干預(yù)組比較, ▲P<0.05。圖3 各組大鼠心肌肌質(zhì)網(wǎng)鈣攝取速率比較

圖4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較(TUNEL染色,放大200倍)

2.5 各組大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3表達量比較

Sham組大鼠Bcl-2蛋白表達高于另外5組, Bax、Caspase3蛋白表達低于另外5組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與HF組比較，低干預(yù)組、中干預(yù)組、高干預(yù)組和西藥組Bcl-2蛋白表達升高, Bax、Caspase3蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 高干預(yù)組、西藥組Bcl-2蛋白表達均高于低干預(yù)組、中干預(yù)組, Bax、Caspase3蛋白表達均低于低干預(yù)組、中干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 低干預(yù)組與中干預(yù)組Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 高干預(yù)組與西藥組Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖5。

表1 各組大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3表達量比較

圖5 免疫印跡法檢測各組大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3表達情況

2.6 各組大鼠鈣轉(zhuǎn)運蛋白CaMKⅡ、RyR2、SERCA2a表達量比較

Sham組大鼠SERCA2a蛋白表達高于另外5組, CaMKⅡ、RyR2蛋白表達低于另外5組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與HF組比較，低干預(yù)組、中干預(yù)組、高干預(yù)組和西藥組SERCA2a蛋白表達升高, CaMKⅡ、RyR2蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 高干預(yù)組、西藥組SERCA2a蛋白表達均高于低干預(yù)組、中干預(yù)組, CaMKⅡ、RyR2蛋白表達均低于低干預(yù)組、中干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 低干預(yù)組與中干預(yù)組CaMKⅡ、RyR2、SERCA2a蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 高干預(yù)組與西藥組CaMKⅡ、RyR2、SERCA2a蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖6。

表2 各組大鼠鈣轉(zhuǎn)運蛋白 CaMKⅡ、RyR2、SERCA2a表達量比較

圖6 免疫印跡法檢測各組大鼠鈣轉(zhuǎn)運蛋白 CaMKⅡ、RyR2、SERCA2a表達情況

2.7 各組大鼠心肌組織TGF-β1、AngⅡ陽性表達率比較

Sham組大鼠心肌組織中TGF-β1、AngⅡ陽性表達率低于另外5組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 低干預(yù)組、中干預(yù)組、高干預(yù)組和西藥組大鼠心肌組織中TGF-β1、AngⅡ陽性表達率低于HF組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 高干預(yù)組、西藥組TGF-β1、AngⅡ陽性表達率均低于低干預(yù)組、中干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 低干預(yù)組與中干預(yù)組TGF-β1、AngⅡ陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 高干預(yù)組與西藥組TGF-β1、AngⅡ陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖7。

3 討 論

中醫(yī)理論認(rèn)為HF屬“心悸”“胸弊”“厥證”范疇，其發(fā)病與氣血、血瘀、水飲有關(guān)，三者相互作用為患，可形成惡性循環(huán)。《傷寒治例》中提到“氣虛停飲，陽氣內(nèi)弱，心下空虛，正氣內(nèi)動而悸也”，闡述了氣血在HF病機中的作用。氣與血相輔相成，兩者可相互作用形成血瘀，血瘀是HF發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，可引發(fā)脈絡(luò)不暢，進而導(dǎo)致臟腑失養(yǎng)，水飲上升[7]。水飲是HF的最終結(jié)果，《血證論》提到“水病則累血，血病則累氣”，進而形成因虛致實、因?qū)嵏摰膼盒匝h(huán)。氣虛血癖水停是HF的病理演變，故HF的治療應(yīng)以正虛為本、血瘀水飲為標(biāo)，進行辨證治療。

表3 各組大鼠心肌組織TGF-β1、AngⅡ陽性表達率比較 %

圖7 各組大鼠心肌組織TGF-β1、AngⅡ陽性表達情況(SP法染色,放大200倍)

本研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血利水方對HF大鼠心肌損傷具有改善作用，這可能與增加心肌肌質(zhì)網(wǎng)鈣攝取量有關(guān)，而HE染色及電鏡觀察結(jié)果提示HF大鼠心肌組織攝取鈣離子能量減弱可能是導(dǎo)致舒張性HF的重要病機。SERCA2a是一種靠近心肌細(xì)胞T管且參與肌漿網(wǎng)重攝取鈣離子的重要鈣離子泵，鈣離子穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)變化可導(dǎo)致肌漿網(wǎng)中鈣離子滲漏，降低SERCA2a表達，進而誘發(fā)心臟疾病，例如HF[8]。相關(guān)研究[9]證實，CaMKⅡ可通過激活氧化應(yīng)激通路活性而加強RyR2活性，進而加重心肌梗死或心肌缺血再灌注損傷，故CaMKⅡ、RyR2激活是導(dǎo)致HF的重要原因。曲美他嗪是臨床常見的改善心肌能量代謝的藥物，可加快心肌細(xì)胞由游離脂肪酸β-氧化向葡萄糖有氧氧化轉(zhuǎn)化，減輕氧化應(yīng)激，抑制心肌細(xì)胞凋亡[10], 故本研究將其作為對照藥物。益氣活血利水方是基于中醫(yī)氣血理論并緊密結(jié)合HF病機所創(chuàng)的組方制劑，包含多味中藥材，已作為強心藥物被廣泛應(yīng)用于臨床且效果較好。益氣活血利水方中，黃芪、黨參為君藥，可補心肺之氣，氣足則血行流暢[11]; 丹參、桃仁、紅花為臣藥，可促血行順暢，補氣則五臟六腑得到濡養(yǎng)，水氣得以正常運化; 桑白皮、葶厲子、豬苓、澤蘭可扶正祛邪、益氣活血利水。于春泉等[12]研究表明，益氣活血藥可改善HF大鼠心肌能量代謝，減少心室重構(gòu)，其作用機制與上調(diào)SERCA2a有關(guān)。吳佳妮[13]發(fā)現(xiàn)，益氣活血方可對慢性心肌缺血大鼠心肌組織起到保護作用，其機制與抑制CaMKⅡ表達有關(guān)。本研究推測，益氣活血利水方可以通過抑制CaMKⅡ、RyR2激活，上調(diào)SERCA2a表達，加快心肌組織對鈣離子的攝取，改善心肌組織代謝紊亂，減輕病理損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(ERS)是指在缺氧及鈣離子平衡失衡的環(huán)境下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被打破，削弱了向細(xì)胞核內(nèi)信號輸出，導(dǎo)致ERS相關(guān)蛋白活性增強，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過負(fù)荷反應(yīng)介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)[14]。HF發(fā)生早期, ERS具有減輕心肌細(xì)胞損傷的作用，但是持續(xù)的應(yīng)激反應(yīng)可損傷細(xì)胞，且隨著疾病發(fā)展可加快細(xì)胞凋亡，機制為ERS可上調(diào)C/EBP同源蛋白(CHOP)表達，調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、Caspase3蛋白水平，加快心肌細(xì)胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn), HF大鼠采用益氣活血利水方灌胃后可以顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡，機制與上調(diào)Bcl-2表達和抑制Bax、Caspase3蛋白有關(guān)。益氣活血利水方中，黃芪歸脾肺二經(jīng)，補中益氣且健脾益肺，可增強心肌收縮力，改善心肌供血，降低心肌耗氧量，具有心肌細(xì)胞保護作用; 黨參補中益氣，和脾胃，除煩渴，劉璐等[16]發(fā)現(xiàn)在壓力負(fù)荷致HF小鼠模型中，黨參可通過改善心肌細(xì)胞電生理，抑制心肌細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與抑制CaMKⅡ表達有關(guān); 丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛等功效，其主要活性成分丹酚酸A可抑制心肌組織缺血，通過抑制炎癥因子表達而減少心肌細(xì)胞凋亡，機制與調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路有關(guān); 紅花可活血潤燥、止痛散腫、通經(jīng)，張穎等[17]發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A通過調(diào)控微小RNA-499(miR-499)表達抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，減少缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞H9C2凋亡。因此，益氣活血利水方可減少心肌細(xì)胞凋亡，并通過調(diào)節(jié)ERS相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3發(fā)揮心肌保護作用。

HF的發(fā)生與心室重構(gòu)密切相關(guān)，心室重構(gòu)可激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS), 升高AngⅡ表達水平，在增加心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子表達的同時，激活多種生長因子的活性[18]。AngⅡ表達升高可激活TGF-β1表達，提高心肌細(xì)胞黏附力，加快心肌膠原細(xì)胞成熟，促進心室重構(gòu)，從而促進HF產(chǎn)生[19]。HF大鼠TGF-β1、AngⅡ表達水平升高，經(jīng)益氣活血化瘀中藥治療后表達水平降低，提示益氣活血藥物可通過抑制神經(jīng)內(nèi)分泌釋放失衡而扭轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，對HF具有防治作用。益氣活血利水方中包含丹參，丹參中的丹參酮ⅡA磺酸鈉能降低AngⅡ誘導(dǎo)的心房成纖維細(xì)胞膠原分泌及合成速率，其機制與抑制血小板反應(yīng)蛋白1(TSP-1)/TGF-β1通路有關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血利水方可以抑制TGF-β1、AngⅡ陽性表達，從而抑制心室重塑，改善HF病理。

綜上所述，益氣活血利水方可以改善HF大鼠心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運，通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少心肌細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)濃度依賴性，其機制可能與抑制TGF-β1、AngⅡ表達水平有關(guān)。本研究尚存在不足之處，例如未進行細(xì)胞試驗及臨床試驗，今后還應(yīng)增加樣本量并進一步完善實驗內(nèi)容深入探討。