α-苦瓜素通過激活JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

冷平，蔣佩文，杜文倩，蔡紫微，張清亮，汪林，吳泳潔，黃敏，李敏惠

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610075；2.金堂縣第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610400；成都醫(yī)學(xué)院，3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4.藥學(xué)院；5.生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；6.科研實(shí)驗(yàn)中心，四川 成都 610500)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是頭頸部腫瘤中最常見的惡性腫瘤，約占口腔癌總數(shù)的90%[1]。近年來，OSCC發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。目前OSCC仍以外科手術(shù)輔以放射治療和化學(xué)藥物治療為主，但由于OSCC早期隱匿、惡性程度高、生長(zhǎng)速度快等原因，預(yù)后未見明顯提升，OSCC患者5年生存率低于50%[2-3]。因此，探索安全有效的OSCC治療方法，特別是高效、靶向、無創(chuàng)的OSCC治療藥物研究具有重要意義。α-苦瓜素(alpha-momorchain，α-MMC)是從苦瓜籽中提取分離的一種核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating proteins，RIPs)，具有抗病毒、抗真菌、抗生育及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能[4]。有研究[5-6]報(bào)道α-MMC具有潛在抗腫瘤活性，而其抗OSCC的活性及機(jī)制還未見報(bào)道。因此，本研究探討了α-MMC對(duì)OSCC HSC-3細(xì)胞的增殖抑制作用及通過激活細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 α-MMC由成都醫(yī)學(xué)院沈富兵老師饋贈(zèng)，提取及鑒定方法見參考文獻(xiàn)[5]。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；碘化丙啶(propidium iodide，PI)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、RIPA強(qiáng)效裂解液購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司(Biosharp)；實(shí)驗(yàn)所用相關(guān)抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.1.3 HSC-3細(xì)胞 保存于成都醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心，其STR鑒定結(jié)果與ATCC一致。根據(jù)ATCC推薦的培養(yǎng)方法，使用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) HSC-3細(xì)胞以1×104/孔的密度接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；加入供試的α-MMC，藥物作用濃度分別為100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.563、0.000 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白孔；藥物作用24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑；孵育2～4 h后，用酶標(biāo)儀(BioTek Powerwave XS，美國(guó))檢測(cè)450 nm處的OD值，計(jì)算不同藥物濃度作用下細(xì)胞的存活率。通過GraphPad Prism 9.0軟件繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線并計(jì)算α-MMC對(duì)HSC-3細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.2 細(xì)胞周期檢測(cè) HSC-3細(xì)胞以5×105/孔的密度接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；加入α-MMC(0.00、5.55、16.66、50.00 μg/mL)處理12 h后，收集細(xì)胞并用70%乙醇固定、Triton X-100打孔，PI室溫避光染色30 min，使用流式細(xì)胞儀(ACEA NovoCyte，美國(guó))檢測(cè)并分析細(xì)胞周期分布比例。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) α-MMC(0.00、5.55、16.66、50.00 μg/mL)作用HSC-3細(xì)胞24 h后，離心收集細(xì)胞；用含Annexin V-FITC和PI兩種熒光染料的結(jié)合液重懸細(xì)胞，室溫避光染色15 min；用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 線粒體膜電位檢測(cè) α-MMC(0.00、5.55、16.66、50.00 μg/mL)處理HSC-3細(xì)胞24 h后，離心收集細(xì)胞；用含有JC-1熒光染料的DMEM完全培養(yǎng)液重懸HSC-3細(xì)胞，37 ℃避光染色15 min；離心洗滌兩次，PBS重懸，用流式細(xì)胞儀采集染色后的細(xì)胞并分析線粒體膜電位的改變情況。

1.2.5 蛋白免疫印跡法(WB)檢測(cè) α-MMC(0.00、5.55、16.66 μg/mL)處理HSC-3細(xì)胞24 h后，用RIPA強(qiáng)效裂解液(已加蛋白酶及磷酸酶抑制劑)裂解細(xì)胞；4 ℃離心收集蛋白上清液，通過BCA法測(cè)定蛋白濃度；采用蛋白免疫印跡法(WB)分析細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況。以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 α-MMC抑制HSC-3細(xì)胞增殖

α-MMC作用HSC-3細(xì)胞24 h、48 h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。GraphPad Prism 9.0軟件繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線，計(jì)算α-MMC對(duì)HSC-3細(xì)胞的IC50值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-MMC以藥物濃度依賴和時(shí)間依賴的方式抑制HSC-3細(xì)胞增殖，其24 h和48 h的IC50值分別為50.38 μg/mL、20.17 μg/mL。見圖1。2.2α-MMC阻滯HSC-3細(xì)胞周期在G2/M期

α-MMC(0.00、5.55、16.66、50.00 μg/mL)處理HSC-3細(xì)胞12 h后，PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期比例，結(jié)果顯示α-MMC作用HSC-3細(xì)胞12 h后，G2/M期的細(xì)胞比例分別為25.83%、31.10%、34.13%、36.32%；即α-MMC阻滯HSC-3細(xì)胞周期于G2/M期。見圖2。

2.3 α-MMC誘導(dǎo)HSC-3細(xì)胞凋亡

α-MMC(0.00、5.55、16.66、50.00 μg/mL)作用HSC-3細(xì)胞24 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC和PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)HSC-3細(xì)胞凋亡比例分別為(5.99±1.50)%、(7.72±0.42)%、(10.84±1.79)%、(12.06±0.86)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 線粒體途徑參與α-MMC誘導(dǎo)HSC-3細(xì)胞凋亡

線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件，JC-1染色法結(jié)果顯示α-MMC誘導(dǎo)HSC-3細(xì)胞線粒體膜電位下降，藥物濃度為50.00 μg/mL的α-MMC作用HSC-3細(xì)胞24 h后，線粒體膜電位下降比例達(dá)15.34%(對(duì)照組為2.19%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

WB結(jié)果顯示，α-MMC誘導(dǎo)HSC-3細(xì)胞線粒體途徑相關(guān)蛋白表達(dá)水平改變，即促凋亡蛋白Bim的表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Mcl-1的表達(dá)及凋亡蛋白PARP原片段表達(dá)降低。以上結(jié)果提示線粒體途徑參與α-MMC誘導(dǎo)HSC-3細(xì)胞凋亡。見圖5。

2.5 JNK信號(hào)通路參與α-MMC對(duì)HSC-3細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)過程

JNK信號(hào)通路參與細(xì)胞多種生理和病理過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等反應(yīng)過程。通過WB檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-MMC能激活JNK信號(hào)通路，即上調(diào)p-MKK4、p-JNK、p-c-Jun的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究結(jié)果提示JNK信號(hào)通路參與α-MMC對(duì)HSC-3細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)過程。見圖6。

3 討論

苦瓜在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中常被用于緩解高血壓、高膽固醇水平和降低血糖[7]，而α-MMC是從苦瓜籽中提取的I型RIP，具有RNA/DNA水解酶活性、蛋白質(zhì)合成抑制性和抗腫瘤等多種生物活性[8]。已有報(bào)道[5-6]表明，α-MMC對(duì)乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞具有抗腫瘤活性，也可以在常氧和缺氧條件下抑制人鼻咽癌CNE2、HONE1細(xì)胞。

本研究顯示，α-MMC可抑制HSC-3細(xì)胞增殖，將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，降低細(xì)胞線粒體膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示促凋亡蛋白Bim表達(dá)增加、抗凋亡蛋白Mcl-1表達(dá)降低。Bim和Mcl-1是Bcl-2家族蛋白的成員，其通過控制線粒體膜的通透性從而在線粒體凋亡通路的調(diào)控中起到重要作用。Bim與Mcl-1相互作用，可使Bak從Mcl-1上解離，激活Bak，引起線粒體外膜通透性改變，從而活化線粒體凋亡途徑[9-10]。Wang等[11]研究顯示，α-MMC通過LRP1介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和JNK的激活誘導(dǎo)L02細(xì)胞凋亡，提示JNK的激活在α-MMC誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中可能起著重要作用。JNK是有絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族的成員，而MKK4是第一個(gè)被鑒定的JNK激活劑[12]，MKK4通過磷酸化JNK的Tyr(酪氨酸)殘基直接激活JNKs，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子或凋亡前蛋白等底物(如：c-Jun、ATF2、p53、Bim、Bax、Bid等)，從而在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13-14]。故本研究通過WB檢測(cè)JNK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，顯示α-MMC可上調(diào)p-MKK4、p-JNK、p-c-Jun的表達(dá)，從而激活MKK4/JNK信號(hào)通路。

綜上，α-MMC對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌HSC-3細(xì)胞具有增殖抑制作用，其可能機(jī)制是α-MMC激活JNK信號(hào)通路觸發(fā)細(xì)胞周期阻滯、并通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。