超聲輔助法提取辣椒多糖的工藝優化及其 抗氧化活性研究

辣椒（Capsicum annuumL.）屬于茄科辣椒屬植物，為一年生或多年生草本植物[1]。辣椒中含有如多糖、色素、辣椒堿和蛋白質等多種有效成分[2-3]，且具有一定的保健功能和營養價值，深受人們的喜愛[4]。

在辣椒的加工生產過程中，會產生大量的辣椒渣、辣椒桿等副產物。研究發現，辣椒渣中的多糖較為豐富[5]。植物多糖具有抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抗衰老[8]和免疫調節[9]等多種生物活性，甚至對艾滋病毒有一定的防御能力[10]，且具有毒副作用小和不易造成殘留等優點[11]。國內外對辣椒渣中研究較多的為蛋白和膳食纖維，對多糖研究較少。而植物多糖的提取、功能性及應用是目前研究的重點[12]。本文以寧夏吳忠市農作物——辣椒為原料，采用超聲輔助法提取辣椒多糖，在單因素試驗的基礎上，利用響應面試驗優化辣椒多糖提取條件，并對產物進行體外抗氧化活性評價，為辣椒渣進一步的綜合利用打下了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒粉，無籽辣椒渣產自寧夏寧楊食品有限公司。

無水乙醇、抗壞血酸、Tris-HCl緩沖溶液、鹽酸、PBS緩沖液、過氧化氫、DPPH、ABTS、鄰二氮菲、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、磷酸鈉、三氯醋酸、FeSO4以及FeCl3等，均為分析純。

1.2 儀器與設備

ME203E型電子天平，美國梅特勒公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A型離心機，上海安亭科學儀器廠；V-5100型紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 辣椒多糖的提取

準確稱取50.0 g辣椒粉末，加入400 mL 95%乙醇，80 ℃下回流提取3 h，提取2次，抽濾，收集濾渣干燥即為脫除辣椒素樣品。取脫除辣椒素樣品30.0 g，加入360 mL蒸餾水，超聲波處理后，離心（4 500 r·min-1，20 min）除去濾渣和不溶物，合并濾液。將上述濾液減壓并濃縮至掛壁狀態，室溫條件下，攪拌并加入80%的乙醇，于4 ℃條件下放置過夜，離心（4 500 r·min-1，10 min），得到沉淀物。將上述沉淀物真空干燥（真空度0.09，溫度35 ℃，時間2 h），粉碎后即可得到辣椒多糖提取物。

1.3.2 辣椒多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定辣椒多糖的含量[13]。

（1）葡萄糖標準曲線的繪制。準確稱取干燥至恒重的葡萄糖0.100 0 g，定容于100 mL容量瓶中，配制成葡萄糖標準溶液。取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL標準溶液分置于試管中，加蒸餾水至2.0 mL，再加5%的苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置10 min后，沸水浴中加熱30 min后冷卻至室溫，于490 nm處測定吸光度。用2.0 mL蒸餾水作為空白對照，制得葡萄糖標準曲線為y=16.031x+0.066 9（R2=0.993 8）。

（2）樣液的測定。根據標準曲線計算得出待測液中葡萄糖的含量，做3次平行。辣椒多糖含量的計算公式：

式中：ω為辣椒多糖含量，mg·g-1；ρ為吸取的待測液中葡萄糖的濃度，mg·mL-1；f為葡萄糖換算多糖的換算因子，f=3.19；m為試樣質量，mg。

1.3.3 單因素試驗

以辣椒多糖含量為指標，分別考察料液比（1∶8、1∶10、1∶12、1∶14和1∶16）（g∶mL）、超聲功率（125 W、150 W、175 W、200 W和225 W）、超聲溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃）以及超聲時間（20 min、30 min、40 min、50 min和60 min）對辣椒多糖含量的影響。

試驗過程中，各因素控制量分別為超聲功率為175 W、超聲溫度為50 ℃、超聲時間為30 min、料液比為1∶12（g∶mL）。

1.3.4 響應面試驗

在確定單因素試驗的較佳條件（超聲功率150 W、超聲溫度70℃、超聲時間40 min）的基礎上進行Box-Behnken試驗設計，以辣椒多糖含量為響應值，設計超聲功率、超聲溫度、超聲時間3因素3水平的響應面進行優化，見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平表

1.3.5 辣椒多糖體外抗氧化活性評價

（1）超氧陰離子的清除活性的測定。采用YANG 等[14]的方法，取 0.05 mol·L-1，pH 8.2的 Tris-HCl緩沖溶液5 mL置于試管中，水浴中（25 ℃）預熱20 min后，加入樣品溶液1 mL，加入預熱的3 mmol·L-1的鄰苯三酚溶液0.5 mL，搖勻，于水浴中反應5 min，再加入8 mmol·L-1的鹽酸1 mL，終止反應，在299 nm處測定溶液的吸光度。按式（2）計算樣品對超氧陰離子的清除率。

式中：Ai為樣品溶液的吸光度值；Aj為Tris-HCl緩沖液和鄰苯三酚的吸光度值；A0為Tris-HCl緩沖液的吸光度值。

（2）羥自由基清除活性的測定。采用范艷麗等[15]的試驗方法，根據式（3）計算樣品對羥自由基的清除率。

式中：A0為空白對照品的吸光度；Ai為樣品溶液的吸光度。

（3）DPPH自由基清除活性的測定。按梁萬年等[16]的試驗方法并做修改，取0.2 mmol DPPH溶液2 mL于試管中，加入2 mL樣品溶液，搖勻，避光靜置30 min。將2 mL DPPH溶液和2 mL乙醇混合作為空白對照。在517 nm處測定各反應混合物的吸光度。根據式（4）計算樣品對DPPH自由基的清除能力。

式中：Ai為DPPH和樣品溶液的吸光度；Aj為乙醇和樣品溶液的吸光度；A0為DPPH和乙醇的吸光度。

（4）ABTS自由基清除活性的測定。按方甜等[17]的試驗方法并做修改。將配制好的7 mmol·L-1的ABTS溶液與2.45 mmol·L-1的過硫酸鉀溶液等體積濃度混合，避光放置12～16 h，得到ABTS+溶液。用蒸餾水稀釋，使其在734 nm波長處的吸光值在（0.7±0.02），取ABTS+溶液3.9 mL，加入樣品溶液0.1 mL，搖勻，室溫放置6 min，于734 nm波長處測定吸光度，以維生素C作陽性對照。根據式（5）計算樣品對ABTS+的清除能力。

式中：A0為空白對照品的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度。

（5）總還原能力測定。按李進等[18]的試驗方法并做修改，取1 mL樣品溶液于試管中，依次加入2.5 mL 的 0.2 mol·L-1磷 酸 鈉 緩 沖 液（pH 6.6） 和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，置于50 ℃水浴中，恒溫20 min后，再加入10%的三氯醋酸溶液2.5 mL，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL和0.1%的FeCl3溶液1 mL，搖勻，靜置10 min，在波長700 nm處測定其吸光度，以維生素C為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對辣椒多糖含量的影響

不同料液比對辣椒多糖含量的影響如圖1所示。隨著提取液的不斷增加，辣椒多糖的含量先增加后減少。在料液比為1∶12時，辣椒多糖含量達到最大，隨著提取液的繼續增加，辣椒多糖含量呈現下降趨勢。因此，選定料液比為1∶12（g∶mL）。

圖1 料液比對辣椒多糖含量的影響圖

2.1.2 超聲功率對辣椒多糖含量的影響

超聲功率對辣椒多糖含量的影響如圖2所示。當超聲功率為150 W時，辣椒多糖含量最大，之后隨著超聲功率增大而下降。這可能是因為超聲功率的增大，破壞了辣椒多糖的結構。因此，選定超聲功率為150 W。

圖2 超聲功率對辣椒多糖含量的影響圖

2.1.3 超聲溫度對辣椒多糖含量的影響

超聲溫度對辣椒多糖含量的影響如圖3所示。當超聲溫度為70 ℃時，辣椒多糖的含量最大，之后隨著超聲溫度的升高，辣椒多糖的含量下降。原因可能是超聲溫度的不斷升高，辣椒多糖容易溶出，但超聲溫度過高，部分辣椒多糖會分解，導致辣椒多糖的含量降低。因此，選定超聲溫度為70 ℃。

圖3 超聲溫度對辣椒多糖含量的影響圖

2.1.4 超聲時間對辣椒多糖含量的影響

超聲時間對辣椒多糖含量的影響如圖4所示。隨著超聲時間的不斷增加，辣椒多糖的含量也不斷增大，超聲時間為40 min時達到最大值，之后辣椒多糖的含量逐漸降低。因此，選定超聲時間為40 min。

圖4 超聲時間對辣椒多糖含量的影響圖

2.2 響應面優化試驗結果分析

基于單因素試驗，以超聲功率、超聲溫度、超聲時間為指標，采用Design Expertv8.0.6 Trial軟件進行3因素3水平的Box-Behnken Design試驗設計。整個試驗設計在中心點處共有17次試驗，試驗隨機完成，結果見表2。

分別對A、B、C各因素和響應值Y進行回歸擬合，得到多糖含量（Y）一次多元回歸方程為Y=84.85+22.01×A-1.28×B+1.03×C+0.45×A×B-0.55×A×C+0.30×B×C-2.51×A2-3.21×B2-3.28×C2。

表2 Box-Behnken響應面實驗設計及結果表

該模型的方差分析結果見表3?；貧w模型P=0.012 8，表明該模型差異顯著。失擬項P=0.676 5＞0.05，說明該模型擬合程度良好[19]。Design-Expert 8.0軟件處理得響應面分析結果見圖5～圖7。

由圖5～圖7可知，3個響應因素在相對應的試驗范圍內對辣椒多糖含量有顯著的影響。通過對各響應因素交互作用對綜合評分影響的響應面及等高線圖分析，使用Design-Expert軟件對模型進行優化，獲得的最優條件為超聲功率158.03 W，超聲溫度68.48 ℃，超聲時間41.10 min，此時辣椒多糖含量為42.35 mg·g-1。

2.3 最佳工藝條件試驗驗證

根據響應面優化的提取工藝條件，基于試驗的實際可操作性，對其進行3次驗證試驗，考察工藝模型的穩定可靠性。根據修正后的模型優化的最佳提取條件（超聲功率158.03 W，超聲溫度68.48 ℃，超聲時間41.10 min）進行辣椒多糖的驗證試驗，由于試驗條件限制，本次試驗設定提取條件為超聲功率150 W、溫度68 ℃，超聲時間41 min，重復測定3次，測得多糖的含量為（40.91±0.13）mg·g-1，與預測值（42.35 mg·g-1）誤差較小。因此，此模型及相關參數準確可靠，能夠預測試驗的最佳工藝條件，可用于辣椒多糖的提取條件研究中。

表3 方差分析表

圖5 超聲功率和超聲溫度對辣椒多糖含量影響的響應面及等高線圖

圖6 超聲功率和超聲時間對辣椒多糖含量影響的響應面及等高線圖

2.4 辣椒多糖的體外抗氧化活性測定

2.4.1 辣椒多糖對超氧陰離子自由基的清除能力

由圖8可知，當樣品濃度在0.1～0.4 mg·mL-1時，維生素C和辣椒多糖對超氧陰離子自由基清除率不斷增加；當樣品濃度在0.5 mg·mL-1時，維生素C的清除率能夠達到99.25%，辣椒多糖的清除率達到74.84%。結果表明，辣椒多糖對超氧陰離子自由基有一定的清除能力，但維生素C比辣椒多糖的清除能力更強。

圖8 辣椒多糖提取物對超氧陰離子自由基的清除能力圖

2.4.2 辣椒多糖對羥基自由基清除活性的測定

由圖9可知，當濃度為0.08 mg·mL-1時，維生素C對羥自由基的清除率為93.1%；辣椒多糖對羥自由基的清除率為76.6%。辣椒多糖對羥基自由基有一定的清除能力，但弱于維生素C。

圖9 辣椒多糖提取物對羥自由基清除活性的測定圖

2.4.3 辣椒多糖對DPPH+清除活性的能力

由圖10可知，當樣品的濃度為0.1 mg·mL-1時，辣椒多糖對DPPH+清除率為49%，濃度為0.4 mg·mL-1時，維生素C對DPPH+清除率達到100%。當濃度超過0.2 mg·mL-1時，辣椒多糖提取物對DPPH+清除率大幅度提升，濃度為0.4 mg·mL-1時其對DPPH+的清除率為70%左右。表明辣椒多糖提取物對DPPH+具有一定的清除能力，且與其質量濃度呈正相關。

2.4.4 辣椒多糖對ABTS+自由基清除活性的能力

由圖11可知，當樣品濃度在0.2～0.5 mg·mL-1時，維生素C和辣椒多糖對ABTS+自由基的清除率呈上升趨勢。濃度為0.1 mg·mL-1時，辣椒多糖對ABTS+的清除率只有12%左右，其清除率隨樣品濃度的增大而增大。在濃度達到0.5 mg·mL-1時，辣椒多糖對ABTS+的清除率達到最大，為18%左右。結果表明辣椒多糖對ABTS+的清除能力較維生素C弱。

圖10 辣椒多糖提取物對DPPH+清除活性的能力圖

圖11 辣椒多糖提取物對ABTS+清除活性的能力圖

2.4.5 辣椒多糖的還原能力

樣品的還原能力能夠反映一定的抗氧化性，抗氧化劑可將Fe3+絡合物還原成綠色或藍色的Fe2+絡合物。試驗通過顯色反應可以測定出Fe3+被還原成Fe2+程度的高低，從而可以判斷出辣椒多糖還原能力的強弱。

由圖12可知，隨樣品濃度的增大，維生素C的還原能力升高，辣椒多糖升高趨勢較為緩慢。當濃度為1.4 mg·mL-1時，維生素C的清除率達到99.8%，而辣椒多糖的清除率最大為25%左右，說明辣椒多糖的還原能力弱于維生素C。

圖12 辣椒多糖提取物的還原能力圖

3 結論

本文采用超聲輔助法提取辣椒多糖，通過單因素試驗及響應面試驗得到辣椒多糖的最佳提取工藝為超聲功率150 W、溫度68 ℃，超聲時間41 min，在最佳工藝條件下，辣椒多糖含量為（40.91±0.13）mg·g-1，與預測值（42.35 mg·g-1）誤差較小。辣椒多糖具有較好的抗氧化活性，其對超氧陰離子、羥基自由基和DPPH+具有較好的清除作用，但清除ABTS+能力和還原能力較弱。本文可為辣椒多糖提取工藝的工業化應用提供數據支持，同時為辣椒渣的利用提供借鑒思路。