面粉中霉菌和酵母計數能力驗證結果分析

能力驗證（Proficiency Testing）是利用實驗室間比對來判定實驗室和檢查機構檢測能力的活動，是檢驗實驗室檢測水平的一項重要手段。實驗室通過參加能力驗證活動，不僅可以清楚了解本機構實驗室的檢測能力和水平，考察檢驗人員的技術水平和設備的性能，還可以從外部尋找與同行之間的差異，發現自身存在的不足，及時有效地提出改進措施，持續改進和完善實驗室的質量控制和管理[1-2]。

霉菌和酵母屬于真菌，在食物中繁殖速度非常快，會產生大量的毒素，對人體造成致命性的危害。例如，黃曲霉毒素就是由黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產生的雙呋喃環類毒素，黃曲霉毒素已被世界衛生組織癌癥研究機構劃定為一類天然存在的致癌物[3]。花生、花生油、玉米等食品中極易受到黃曲霉毒素的污染。同時，霉菌和酵母也是評價食品衛生質量的指示菌，已成為食品中常規的檢測項目之一[4]。目前，《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）是普遍采用的霉菌和酵母檢驗方法，該方法操作簡單，但由于霉菌和酵母自身繁殖特點，前期生長緩慢，后期急劇生長，蔓延生長甚至連片，導致計數時比較困難，因此霉菌和酵母計數也是考察實驗室和檢測人員技術水平的重要參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

本次能力驗證樣品由中國食品藥品檢定研究院提供，2份待測樣品，每份樣品包含裝有菌球的西林瓶1瓶（規格：1粒/瓶）和相同編碼的面粉1袋（規格：25 g/袋），2份樣品的編號分別為TF03280014和TF03280027。

1.2 培養基及試劑

孟加拉紅瓊脂，北京陸橋技術股份有限公司；0.85%無菌生理鹽水，北京陸橋技術股份有限公司。

1.3 儀器設備

無菌均質器S-154，上海德記行科技發展公司；MJ-250BSH-Ⅲ型霉菌培養箱S-01，上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品處理

在生物安全柜內打開裝有霉菌和酵母菌球的西林瓶，并將霉菌和酵母菌球加入到盛225 mL 0.85%無菌生理鹽水的無菌均質袋中，充分均質混勻。再將與西林瓶相同編碼的面粉基質加入到上述生理鹽水中，充分均質混勻，作為1∶10的樣品勻液。

1.4.2 樣品稀釋

（1）吸取1∶10樣品勻液1 mL，加入到盛有9 mL無菌生理鹽水的無菌試管中，混勻，制成1∶100的樣品勻液，依此法繼續用無菌生理鹽水進行10倍系列梯度稀釋，制備1∶1 000的樣品勻液。

（2）分別吸取各稀釋級的樣品勻液1 mL于無菌平皿內，每個稀釋級做2個平皿。同時，分別取1 mL 0.85%無菌生理鹽水加入到兩個無菌平皿內作空白對照。及時將20～25 mL冷卻至46 ℃的孟加拉紅瓊脂培養基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻，置水平臺面待培養基完全凝固。

（3）培養。將上述凝固后培養基，正置平板，放置于28 ℃培養箱中培養至第5天，逐日觀察并記錄結果。

2 結果與分析

2.1 不同取樣方式下霉菌和酵母的計數結果

面粉一般指小麥粉，即由小麥磨成的粉狀物。面粉主要成分是淀粉，是不溶于水的，會形成懸濁液[5]，面粉在0.85%的無菌生理鹽水中也不能完全溶解，會形成懸濁液，放置1～2 min面粉會下沉至底部，所以取樣方式對檢測結果會有一定影響。本實驗設計兩種取樣方式。第一種是用無菌均質器均質1 min混勻后直接取懸濁液進行后續檢測，第二種是用無菌均質器均質1 min混勻后放置1～2 min取上清液進行后續檢測。從計數結果來看，第二種取樣方式霉菌和酵母數均比第一種取樣方式多，詳見表1、表2。本實驗選取第二種取樣方式（上清液）的結果報數，TF03280014的Z值為1.68，TF03280027的Z值為0.66，兩份樣品|Z|值均小于2.0，|Z|值≤2為滿意結果，故兩份樣品結果均為滿意。

表1 TF03280014霉菌和酵母計數結果表

表2 TF03280027霉菌和酵母計數結果表

2.2 孟加拉紅培養基上霉菌和酵母生長形態變化

孟加拉紅瓊脂培養基中的氯霉素可抑制細菌的生長，孟加拉紅是一種選擇性抑菌劑，也可抑制細菌的生長，并減緩某些霉菌菌落的蔓延生長。孟加拉紅瓊脂培養基可選擇性地抑制細菌生長而不影響霉菌和酵母的生長，排除細菌生長帶來的干擾。

在孟加拉紅培養基上培養霉菌和酵母，到第2天才開始有菌落生長，以10-1稀釋級霉菌和酵母培養第2～5天的生長形態為例來描述霉菌和酵母生長趨勢，見圖1。霉菌和酵母均在培養至第2天時可以看到明顯的菌落，第3～5天霉菌迅速生長，酵母相對比較小，霉菌菌絲蔓延成片。對于霉菌而言培養至第3天的時候菌落已出現連片現象，從正面不易計數，從背面可以清晰看見菌核，易于計數。實驗中發現在菌落數比較少的稀釋級平板上（如10-2稀釋級），培養至第2天到第5天的菌落數基本沒有變化。

綜合以上描述，觀察結果應逐天進行，尤其是培養2～3 d時，霉菌計數比較關鍵。酵母相對于霉菌菌落較小，菌落形態清晰，易于計數。

圖1 TF03280014霉菌和酵母10-1級兩個平行平皿培養后的菌落形態變化圖

3 結論與討論

3.1 影響計數的關鍵因素

3.1.1 取樣方式

本次能力驗證設計了兩種取樣方式來考察霉菌和酵母計數結果。第二種取樣方式（取上清液開展后續試驗）比第一種取樣方式（取懸濁液開展后續試驗）計數結果偏多，分析原因有兩個方面。①經過均質的樣品勻液可認為是菌株均勻分布于0.85%的生理鹽水中，放置一會兒面粉顆粒會下沉至底部，此時分別吸取1 mL樣品懸濁液和上清液，懸濁液中的面粉顆粒會占據一部分的體積，上清液中面粉顆粒相對較少菌含量相對較高。②面粉顆粒在后續觀察時會影響視線，容易少計數，所以本實驗選擇取上清液的結果報數。

3.1.2 計數方法

（1）培養時間。實驗觀察發現霉菌和酵母從培養至第2天開始計數，此后霉菌生長速度很快，至第4天菌絲布滿整個平板，霉菌和酵母相互覆蓋影響準確計數。培養至第5天時，從正面無法計數，只能從背面計數（圖2）。此時計數相對來說誤差會比較大。同時霉菌會產生菌絲，在觀察結果的過程移動平板，會造成菌絲飄散，形成次生菌。

圖2 TF03280014培養至第5天霉菌和酵母的菌落形態圖

（2）菌落形態。每份樣品中都有霉菌和酵母，霉菌生長速度快，后期逐漸形成褶皺，第4天、第5天霉菌布滿整個平板，此時霉菌從正面難以計數，從背面計數霉菌主要以菌核計算（如圖2），但是有些菌核不明顯，此時能不能記為單獨菌落又因人而異（如圖3中B處）。霉菌培養至第4天時就產生明顯的褶皺，從背面看像是兩個菌核（如圖3中A處），容易計成兩個菌落。部分酵母長在培養基內部，部分長在培養基表面，霉菌蔓延至整個平皿的時候掩蓋住部分酵母，正面難以準確計數，而從背面計數時因酵母有大有小，小的菌落與面粉顆粒容易混淆，菌落計數存在誤差（如圖4標識圓圈內）。

圖3 TF03280027 10-2級在孟加拉紅瓊脂上培養至第4天的形態（背面觀察）圖

圖4 TF03280014 10-2級在孟加拉紅瓊脂上培養至第4天的形態（背面觀察）圖

3.2 能力驗證中關鍵控制點

3.2.1 人員

檢測人員是影響實驗結果準確性和真實性至關重要的因素。食品微生物檢測人員需具備食品微生物檢測的專業知識，并有相關的實習經驗或工作經驗，檢測人員需通過食品微生物檢測相關理論知識和實操技能考試，取得上崗證后方可上崗。檢測人員實驗操作熟練度和規范性直接影響實驗結果，檢測人員可每年參加專業機構組織的“生物安全”“食品微生物檢測理論和實操”等主題的培訓班來提高自身理論知識和檢驗水平，不斷積累總結好的經驗，優化自身知識結構，提升自身綜合素質。實驗室可結合日常工作情況、外部審核、能力驗證等對檢驗人員定期開展監控。對于特殊情況，如新項目、新設備、新人員上崗、投訴和結果偏離等情況應隨時開展監控[6]。

3.2.2 實驗條件

實驗室應配備滿足檢驗要求的儀器設備，設備應檢定合格，使用之前應做好確認，并定期做期間核查；實驗室應配備符合要求的培養基及試劑，培養基應驗收合格，使用之前應完成質量控制，因孟加拉紅瓊脂培養基見光易分解，配制好的培養基可應避光放置，培養基最好現用現配，不要放置于冰箱中過夜保存。

3.2.3 實驗方法

確認樣品完好無誤后，檢測人員應認真閱讀相關能力驗證作業指導書，嚴格按要求處理樣品，在轉移西林瓶里的菌球時，應注意看菌球是否有散落，可用稀釋液反復沖洗西林瓶，保證目標菌盡可能完全轉移，目標菌的轉移對后續菌落計數至關重要。后續檢測應嚴格按照GB 4789.15—2016要求進行，操作要規范。微量移液器卡緊槍頭，防止漏液，保持豎直，在轉移過程中不要碰到試管內側；每次稀釋要充分混勻，操作過程要規范，防止樣液噴濺；培養基溫度需冷卻至46 ℃，加入培養基后需立即轉動平皿混勻，力度不要過大，防止培養基濺出。

3.2.4 結果計數

在本次能力驗證中發現，霉菌和酵母一般在48 h以后開始生長，所以本文建議從培養至第2 天開始計數，計數過程中注意輕拿輕放平，勿反復翻轉平板，防止霉菌菌絲飄散形成次生菌。霉菌后期生長速度很快，菌絲蔓延，計數比較困難，霉菌在培養至第3天、第4天和第5天時菌落數基本一致，本文建議霉菌計數可密切關注培養至第3天的結果，酵母計數可重點關注培養至第4天、第5天的結果。