反應體系混勻與否對新型冠狀病毒實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應檢測結果的影響

楊志，秦冬梅*，周波，肖光軍

(1.大英縣人民醫院，四川 大英 629300；2.遂寧市中心醫院，四川 遂寧 629000)

自2020年1月11日初步判定“不明原因病毒肺炎”的病原體為一種新的冠狀病毒以來[1]，新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)逐漸在全球范圍內大流行，且不斷變異，世界衛生組織已發布多個需要關注的變異株(VOC)和需要留意的變異株(VOI)。2021年11月9日在南非第一次被檢測出、并逐漸成為世界各地流行的優勢毒株的奧密克戎(Omicron)變異株正是屬于VOC，初步證據表明其對人群再感染風險增高[2]；另外，已接種新冠疫苗的病例分類以無癥狀感染者為主[3]。以上雙重因素使病毒可能會更快速且隱匿地傳播，增加了及早發現并迅速控制疫情的難度。因此，當前疫情防控壓力仍然巨大，不可松懈。

2021年8月國家衛生健康委員會臨床檢驗中心舉辦的新型冠狀病毒德爾塔變異株核酸檢測室質評活動中，有來自31 個省(市、自治區)的共8 488 家實驗室參加[4]，這些實驗室為全面落實“外防輸入、內防反彈”的防控策略和“及時發現散發病例和聚集性疫情”提供了有力保障[5]。然而在上述實驗室中，屬于新建的比例很高，工作人員缺乏核酸檢測實踐經驗的比例也相應很高，但是新型冠狀病毒核酸檢測結果的準確性對疫情防控來說至關重要，故任何可能對結果準確性造成影響的因素都值得探討。實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)是我國檢測新冠病毒核酸時使用比例最高的方法[4]，其反應體系(擴增試劑和核酸樣本的混合液)是需要先混勻再瞬離后上機檢測，還是直接瞬離后上機檢測，《全國臨床檢驗操作規程》[6]和試劑說明書等相關資料均未對此給出明確的答案，亦未見相關報道。本研究探討了上述操作差異對檢測結果的影響，以指導實驗室《標準操作規程》的編寫，從而規范人員操作，保證新型冠狀病毒核酸檢測結果的準確性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑及耗材

兩種新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)：試劑1由圣湘生物科技股份有限公司提供，試劑2由達安基因股份有限公司提供。8聯PCR管(0.2 mL，光學平蓋)則由帝恩生物科技(香港)有限公司提供。生理鹽水由四川美大康佳樂藥業有限公司提供。

1.1.2 儀器

全自動醫用PCR分析系統(Gentier96E)由西安天隆科技有限公司提供，快速混勻器(XK80-A)由江蘇新康醫療器械有限公司提供，掌上離心機(D1008E)由大龍興創實驗儀器(北京)股份公司提供。

1.2 樣本來源

以試劑盒中的陽性對照為試驗樣本，其中樣本1為試劑1的陽性對照，樣本2為試劑2的陽性對照。

1.3 方法

1.3.1 試劑1的檢測方法

用生理鹽水對樣本1進行系列稀釋，制備成含不同初始模板數量的試驗樣本：高濃度試驗樣本(1∶1)、中濃度試驗樣本(1∶10)和低濃度試驗樣本(1∶100)，每個濃度水平均設置混勻組和未混勻組，每組各8 孔。用試劑1進行檢測，觀察每個濃度水平兩組的檢測結果，以閾值循環數(Ct)表示。觀察每個濃度水平兩組檢測結果的差異。兩組試驗按下文1.3.3的處理方法。試驗參數：樣本量20 μL、試劑量30 μL。循環條件：逆轉錄50 ℃，30 min；預變性95 ℃，1 min；擴增95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s(采集熒光)，循環45 次。

1.3.2 試劑2的檢測方法

用生理鹽水對樣本2進行系列稀釋，制備成含不同初始模板數量的試驗樣本：高濃度試驗樣本(1∶1)、中濃度試驗樣本(1∶10)和低濃度驗樣本(1∶100)，每個濃度水平均設置混勻組和未混勻組。每組8 孔，用試劑2進行檢測，觀察每個濃度水平兩組檢測結果(以Ct值表示)的差異。兩組試驗按下文1.3.3的處理方法。試驗參數：樣本量5 μL、試劑量20μL。循環條件：逆轉錄50 ℃ 2min；預變性95 ℃2 min；預擴增95 ℃ 5 s，60 ℃ 35s，循環10次；擴增95 ℃ 5 s，65 ℃ 35 s(采集熒光)，循環32 次。

1.3.3 混勻組與未混勻組的處理方法

混勻組的處理方式：將樣本加入裝有擴增試劑的8聯管，蓋嚴管蓋，先用掌上離心機離心5 s(將管壁液體集中于管底)，再用快速混勻器振蕩10 s，最后用掌上離心機離心15 s，立即用PCR分析儀進行擴增分析。未混勻組的處理方式：將樣本加入裝有擴增試劑的8聯管，蓋嚴管蓋，用掌上離心機離心15 s，立即用PCR分析儀進行擴增分析。每對混勻組和未混勻組平行進行，其所用樣本、試劑均為同批同瓶，耗材批號相同，儀器設備為同一臺。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 試劑1各濃度水平混勻組與未混勻組的檢測結果比較

用試劑1檢測時，每個濃度水平混勻組與未混勻組的檢測結果見表1；兩個靶基因各濃度水平的組間結果比較，差異均無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 試劑1混勻組與未混勻組Ct值比較

2.2 試劑2各濃度水平混勻組與未混勻組的檢測結果比較

用試劑2檢測時，每個濃度水平混勻組與未混勻組的檢測結果見表2。各濃度水平的兩組結果進行比較，結果顯示高濃度兩個靶基因和中濃度N基因的組間差異有統計學意義(P<0.05)，其余組間差異無統計學意義(P>0.05)。對有統計學意義的組間差異進一步分析，結果顯示各組間的均值之差在0.5以內則在臨床可接受范圍，即可認為這些組間差異無臨床意義(見表3)。

表2 試劑2混勻組與未混勻組Ct值的比較

3 討 論

新型冠狀病毒核酸檢測結果是確定新冠肺炎確診病例和無癥狀感染者的關鍵依據[5]，其準確性的重要性不言而喻。我國普遍使用實時熒光RT-PCR法，在檢測核酸時具有操作簡便、效率高、特異性強等優點[8]，但樣本的質量、檢測人員的操作、儀器設備的狀態、試劑的質量、核酸污染、非特異性擴增等眾多因素都會影響檢測結果[9]。為了規范實驗室工作人員的操作，以提高人員之間和實驗室之間檢測結果的準確性和可比性，本研究初步探討了反應體系混勻與否對新型冠狀病毒實時熒光RT-PCR檢測結果的影響。

本研究結果顯示，對于逆轉錄時間較長的實時熒光PCR試劑(試劑1)而言，其檢測高、中、低濃度水平的樣本時，各混勻組與非混勻組檢測結果的差異均無統計學意義(P>0.05)，說明其反應體系混勻與否對檢測結果無影響；而逆轉錄時間較短的試劑(試劑2)在檢測不同濃度水平的樣本時則表現出一定差異：部分組間結果的差異具有統計學意義(P<0.05)，但進一步分析發現，這些組間的結果差異在0.5以內。而實時熒光PCR試驗的樣本初始模板量X與Ct值的關系如下：

logX=-Ct×log(1+E)+logYCt

其中，E表示擴增效率，YCt表示熒光擴增信號達到閾值時擴增產物的量[10]。

根據以上關系，可以計算出當Ct值偏差<0.5時，logX差異不足0.15(假設擴增效率E為1)，滿足分子診斷領域對總允許誤差(TEa)的要求(靶值±0.4對數值)[11]，陳培松等[7]認為偏差小于1的Ct值可視為一致。因此可以認為試劑2檢測不同濃度水平的樣本時，反應體系混勻與否對檢測結果亦無影響。對于兩種試劑所表現出的細微差異，可能與液體間的擴散特性有關，試劑和樣本加在一起后，即使不通過振蕩混勻，兩者也可通過液體間相互擴散而自然達到混勻狀態，但自然混勻與溫度、時間等因素有關：在一定范圍內，溫度越高、時間越長則兩者混勻越充分。兩種試劑的逆轉錄溫度均為50 ℃，較高的溫度有利于樣本與試劑自然混勻，但兩者在此階段的時長差別顯著，可能是造成它們表現不同的原因之一。試劑1的逆轉錄時間為30 min，試劑2為2 min。對于試劑1來說，除去自然混勻所需的時間，此階段剩余的時間仍然足夠長，兩組反應體系反應的充分程度幾乎無差別，所以組間結果無差異；而對于試劑2，因其此階段時間太短，未混勻組反應體系反應的充分程度可能不及混勻組，所以組間結果有細微差異。至于試劑2在檢測不同濃度樣本時所表現出的差異，則可能與檢測系統的精密度隨分析物濃度降低而降低這一規律有關，即對于低濃度樣本，其檢測結果的精密度相對較差[12]，掩蓋了操作差異引起的結果偏差。從表1和表2也可以看出，隨著樣本濃度降低，檢測結果的精密度變小(標準差變大)。

綜上所述，本研究認為：在用實時熒光RT-PCR法檢測新型冠狀病毒核酸時，反應體系是否預先混勻對于檢測結果無影響。因此在工作中反應體系不必進行瞬離前的混勻操作，可以減少操作步驟，提高工作效率，其效果在大規模核酸檢測時會顯得更明顯。

本研究的局限性在于：樣本來自于試劑盒的陽性對照，可能與臨床樣本存在差異；兩種試劑來自于不同廠家，兩者除了逆轉錄時長不同，樣本與試劑的體積亦不同，因此兩種試劑表現出的細微差異不能充分說明是由逆轉錄時長不同造成的，亦可能與樣本試劑體積有關。本研究所選用試劑種類較少，結論是否適用其他相同方法的試劑盒還有待驗證。