DC-CIK誘導宮頸癌細胞休眠的實驗研究

趙 晴，劉 艷，鄧淵潤

宮頸癌為臨床最常見的女性上皮性惡性腫瘤，多形成于宮頸上皮組織瘤變[1-2]。宮頸癌具有發病率高、治療難度大、病死率高等特點，據不完全統計，宮頸癌發病率、病死率均為婦科惡性腫瘤首位，多發于中年患者[3-4]。放化療、外科手術等均為宮頸癌的常用治療手段，但因個體差異，治療效果差異較大。樹突狀細胞(dendritic cell, DC)-殺傷細胞(killer cell, CIK)生物細胞免疫療法在惡性腫瘤臨床治療中應用較為廣泛，可促進免疫細胞的恢復[5]。張春利 等[6]研究表明，DC-CIK生物細胞可對宮頸癌細胞具有較高的殺傷效應，但為對其具體作用機制進行分析。該研究建立DC-CIK共培養體系對宮頸癌細胞進行干預，旨在探究DC-CIK細胞誘導宮頸癌細胞休眠的作用及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑宮頸癌SiHa細胞購自中國醫學科學院。小鼠抗兔磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)抗體(美國Hyclone公司)；大鼠抗小鼠蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)抗體(中國Selleck公司)；大鼠抗兔哺乳動物西羅莫司靶蛋白(mammalian target protein of sirolimus, mTOR)抗體(美國Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠上皮性鈣黏附素(epithelial calcium adhesins, E-cadherin)抗體(美國BD公司)；大鼠抗小鼠MMP-9抗體(德國Sigma公司)；PCR試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司；貨號KG204]，matrigel基底膜膠(上海善然生物科技有限公司；貨號356234)，四唑鹽(MTT)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司提供；貨號GL0510-OYT)；Transwell板(上海偉進生物科技有限公司；貨號3422)。

1.2 宮頸癌SiHa細胞培養對凍存宮頸癌SiHa細胞進行火浴處理，之后置于含10%胎牛血清培養基，3 000 r/min離心后重懸、傳代，將培養基置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。

1.3 DC細胞、CIK細胞培養選取2020年3月-2021年3月于南方醫科大學第三附屬醫院就診的、未進行過相關治療的宮頸癌患者10例，Ⅲ期6例，Ⅳ期4例，共抽取患者清晨空腹靜脈血60 ml，添加200 μl肝素鈉。取患者淋巴細胞分離液50 ml，以每管5 ml分于10支離心管，均添加靜脈血6 ml，之后2 500 r/min離心15 min。取2個消毒后的50 ml離心管，取離心后上層血清置于一管內，取離心后中層細胞置于另一管中，并添加生理鹽水將管中液體補至50 ml，細胞計數后5 000 r/min離心10 min。提取5×107個細胞用于DC細胞培養，其余細胞用于CIK細胞培養，此時記為第1天。添加20%自體血清、腺嘌呤核苷三磷酸及1 000 μg/ml IFN-γ，次日添加100 μg/ml IL-1α、300 μg/ml IL-2、50 ng/ml CD3單克隆抗體，觀察細胞數量，相應補加培養基擴增，第8天與DC細胞共培養。DC細胞接種至6孔板(密度5×107個/ml)，2 ml/孔，此時記為第1天，添加500 μg/ml IL-4、1 000 μg/ml GM-CSF，第4天補加2 ml DC培養液，第6天添加抗原，第7天添加500 μg/ml TNF-α。第8天使用巴氏管收集DC細胞(鋪板密度1×107個/ml)及CIK細胞(1×109個/ml)混合共培養，根據混合后細胞數量補加培養基擴增，第10天對培養的DC-CIK進行微生物檢測，第14天用于實驗。

1.4 細胞培養及分組取生長狀態較好的對數生長期SiHa細胞進行胰酶消化，并接種于96孔板，濃度為每孔5×104個，將96孔板置于細胞培養箱(37 ℃、5% CO2)內過夜培養。分別將100 μl培養基、培養5 d的DC細胞、培養7 d的CIK細胞及聯合培養3 d的CIK-DC細胞每孔均為1×105個接種于96孔板(鋪有靶細胞)，分別為宮頸癌組、DC組、CIK組、DC-CIK組。各組細胞均于細胞培養箱培養1 d，CCK-8試劑加至孔內(20 μl/孔)，再次培養2 h，觀察各組細胞存活率。

1.5 細胞生物學行為檢測

1.5.1MTT比色法檢測細胞增殖能力變化 使用0.125%胰蛋白酶消化細胞，制備單細胞懸液并接種于96孔板，每組3個復孔，2×103個/孔，將96孔板置于37 ℃、5% CO2培養箱中，分別于培養24、48、72 h加入20 μl MTT，計算細胞增殖率。

1.5.2TUNEL法檢測細胞凋亡 4組細胞均添加蛋白酶K 20 μg/ml進行培養，1.5 h后去除蛋白并添加平衡緩沖液100 μl及TdT酶反應液，置于遮光環境中培養1 h后添加100 μl SSC溶液，靜置30 min后取出清洗，DAPI復染后遮光培養10 min，清洗、封片觀察。

1.5.3Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 小室濕化后添加細胞懸液200 μl，下室內添加細胞培養液(含10%胎牛血清)，使用細胞培養箱室內培養1 d，第2天取出后使用PBS液清洗，之后使用4%多聚甲醛進行染色，靜置30 min后使用顯微鏡觀察。

1.5.4劃痕實驗檢測細胞遷移能力 使用胰蛋白酶消化處理細胞，細胞懸液接種于6孔板，使用10 μl移液器槍頭垂直于孔板底部畫直線，使用PBS緩沖液清洗后室內培養1 d，拍照計算劃痕。

1.6 Western blot法檢測細胞凋亡、侵襲蛋白表達4組細胞分別取50 μg蛋白，煮沸，蛋白變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳并轉膜，使用Western封閉液室內封閉3 h，之后加入TBST稀釋的羊抗鼠PI3K、Akt、mTOR、E-cadherin、MMP-9(1 ∶2 500)一抗，并于5 ℃環境孵育1 d，取出后使用PBS清洗，之后添加二抗(1 ∶5 000)孵育1 h，取出清洗后進行顯色、曝光、成像，以β-actin為內參，檢測條帶灰度值，計算PI3K、Akt、mTOR、E-cadherin、MMP-9相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞增殖、凋亡能力變化如表1所示，24、48、72 h時，宮頸癌組、DC組細胞增殖率、凋亡率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與宮頸癌組、DC組比較，CIK組、DC-CIK組細胞增殖率較低，凋亡率較高，差異有統計學意義(P<0.05)；與CIK組比較，DC-CIK組細胞增殖率較低，凋亡率較高，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組細胞增殖、凋亡能力變化

2.2 各組細胞存活率比較如圖1所示，與宮頸癌組、DC組比較，CIK組、DC-CIK組細胞存活率較低，且DC-CIK組細胞存活率低于CIK組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 各組細胞存活率比較與宮頸癌組比較：*P<0.05；與DC組比較：#P<0.05；與CIK組比較：△P<0.05

2.3 各組細胞侵襲、遷移能力比較如表2、圖2所示，宮頸癌組、DC組細胞侵襲、遷移細胞數比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與宮頸癌組、DC組細胞比較，CIK組、DC-CIK組細胞侵襲、遷移細胞數較低，差異有統計學意義(P<0.05)；與CIK組細胞比較，DC-CIK組細胞侵襲、遷移細胞數較低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組細胞侵襲、遷移能力比較(個，

圖2 各組細胞侵襲情況 結晶紫染色 ×100A：宮頸癌組；B：DC組；C：CIK組；D：DC-CIK組

2.4 各組細胞凋亡蛋白相對表達量比較如表3、圖3所示，宮頸癌組、DC組PI3K、Akt、mTOR相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與宮頸癌組、DC組比較，CIK組、DC-CIK組細胞PI3K、Akt、mTOR相對表達量較低，差異有統計學意義(P<0.05)；與CIK組比較，DC-CIK組細胞PI3K、Akt、mTOR相對表達量較低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組細胞凋亡蛋白相對表達量比較

圖3 Western blot法檢測PI3K、Akt、mTOR表達A：宮頸癌組；B：DC組；C：CIK組；D：DC-CIK組

2.5 各組細胞侵襲相關蛋白相對表達量比較如表4、圖4所示，宮頸癌組、DC組細胞E-cadherin、MMP-9相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與宮頸癌組、DC組比較，CIK組、DC-CIK組細胞E-cadherin相對表達量較高，MMP-9相對表達量較低，差異有統計學意義(P<0.05)；與CIK組比較，DC-CIK組細胞E-cadherin相對表達量較高，MMP-9相對表達量較低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 各組細胞侵襲相關蛋白相對表達量比較

圖4 Western blot法檢測E-cadherin、MMP-9表達A：宮頸癌組；B：DC組；C：CIK組；D：DC-CIK組

3 討論

有研究[7]顯示，宮頸癌發病早期臨床特征并不明顯，隨著疾病的進展患者可能出現陰道流血、下肢水腫、心慌氣短、皮炎、尿急、陰道排液等情況，進而對生存質量、日常生活造成了影響。HPV感染、不良孕產史、性行為等均為宮頸癌發病主要危險因素，但目前宮頸癌發病機制尚不清楚[8]。大量臨床研究[9]顯示，DC-CIK細胞在肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤治療過程中具有較為理想的臨床療效，DC-CIK細胞可通過分泌IL-12等細胞因子激活初始T細胞，進而對適應性免疫應答起到了誘導作用，最終發揮了抗腫瘤的作用。

細胞實驗研究[10]顯示，惡性腫瘤的發展演進與惡性腫瘤細胞的增殖能力、凋亡能力具有密切聯系。有學者研究表明，對宮頸癌細胞增殖、凋亡、周期分布等生物學行為進行調控，能夠抑制癌細胞不斷發展擴散，這也是臨床治療宮頸癌的關鍵[11]。本研究顯示，建立DC-CIK共培養體系后對宮頸癌細胞進行干預，宮頸癌細胞增殖率下降、凋亡率上升，并且隨著細胞培養時間的推移，使用DC-CIK細胞干預的宮頸癌細胞增殖率逐漸下降，凋亡率逐漸上升，細胞存活率較低，其原因為，建立DC-CIK共培養體系干預，DC-CIK細胞兼具DC細胞提呈抗原及CIK細胞殺滅癌細胞的作用，因而能夠起到抑制宮頸癌細胞增殖、促進凋亡、抑制癌細胞存活率的作用。

研究[12]表明，PI3K/Akt/mTOR通路在細胞生物學行為變化過程中能夠發揮重要作用。PI3K、Akt、mTOR均為PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白，大量實驗研究[13]結果顯示，抑制PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白PI3K、Akt、mTOR表達，能夠抑制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡，對惡性腫瘤的治療和患者預后改善具有重要意義。本研究顯示，建立DC-CIK共培養體系后對宮頸癌細胞進行干預，宮頸癌細胞PI3K、Akt、mTOR表達大幅下調，說明使用DC-CIK細胞干預可能通過調控PI3K/Akt/mTOR通路表達，起到干預宮頸癌細胞增殖、凋亡的作用，由此推測，DC-CIK干預對宮頸癌細胞增殖起到抑制作用的機制可能是調控PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達。

大量研究[14]表明，癌組織的不斷發展擴散與癌細胞侵襲遷移能力有密切聯系。有研究[15]顯示，抑制宮頸癌細胞侵襲、遷移能力對宮頸癌細胞的發展擴散具有抑制作用。有研究[16]表明，E-cadherin、MMP-9表達變化與細胞侵襲、遷移能力密切相關。本研究顯示，建立DC-CIK共培養體系后對宮頸癌細胞進行干預，宮頸癌細胞侵襲、遷移數下降，且E-cadherin表達大幅上調，MMP-9表達大幅下調，說明使用DC-CIK細胞干預能夠抑制宮頸癌細胞侵襲、遷移能力，其分子機制可能是因為使用DC-CIK細胞干預能夠調控細胞侵襲相關蛋白E-cadherin、MMP-9表達。

綜上所述，建立DC-CIK共培養體系，并對宮頸癌細胞進行干預，能夠抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲、遷移，促進宮頸癌細胞凋亡，從而起到誘導宮頸癌細胞休眠的作用，其機制可能是使用DC-CIK細胞培養可能調控PI3K/Akt/mTOR通路蛋白及侵襲相關蛋白表達，由此推測，DC-CIK生物細胞免疫療法可能對宮頸癌細胞增殖具有一定的抑制作用，為宮頸癌的臨床治療研究提供新的方向。