靶向HER2和CLDN18.2的并聯嵌合抗原受體T細胞降低對胃癌的脫靶效應

孟 濤，曾祥岳，金 博

胃癌是世界上第五大常見癌癥[1-2]。目前，手術切除是胃癌根治的唯一方法[3]，迫切需要開發新的治療手段以應對這一難題。基于嵌合抗原受體修飾的T細胞的免疫治療已經被證明是一種很有前景的癌癥治療策略[4-5]。由于在實體腫瘤中缺乏特異性的腫瘤抗原，嵌合抗原受體T(chimericantigenreceptor T,CAR-T)細胞有可能造成嚴重的脫靶效應[6]。因此，發展限制潛在脫靶毒性的策略是必要的。研究人員利用“與”門邏輯，使得CAR-T細胞只有在同時識別兩種腫瘤相關抗原時才可以被充分激活[7]。該研究通過構建雙嵌合抗原受體T細胞，分別靶向在胃癌中高表達的閉合蛋白18亞型2(claudin-18 isoform 2，CLDN18.2)和人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2[8-9])，探討這種CAR-T細胞是否可以降低脫靶效應，并發揮抑制胃癌細胞生長的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞系 胃癌細胞系AGS、MGC803和MKN45購自中科院上海細胞庫，細胞培養于含有10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養基中。

1.1.2主要試劑 Ficoll-Paque試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司；CD3+T細胞分選磁珠購自德國美天旎生物科技有限公司；人CD3/CD28激活磁珠購自美國Invitrogen公司；Polybrene購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)細胞毒性檢測試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司；兔抗人CD3抗體、兔抗人HER2抗體和兔抗人CLDN18.2抗體購自美國Proteintech公司；FITC標記的鼠抗人HER2抗體和PE標記的鼠抗人CLDN18.2抗體以及FITC標記的鼠抗人CD4抗體和PE標記的鼠抗人CD8抗體購自美國ebioscience公司；鼠抗人GAPDH抗體和羊抗兔、羊抗鼠二抗購自杭州聯科生物科技有限公司；ECL發光試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司；DAB顯色試劑和蘇木精染色液購自武漢塞維爾生物科技有限公司；過表達CLDN18.2或HER2的慢病毒及過表達Cz或Hbb的慢病毒購自上海漢恒生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器 流式細胞儀(型號：FACSCanto II)購自 Becton-Dickinson公司；顯微鏡(型號：BX53)購自奧林巴斯公司。

1.2 Western blot檢測HER2和CLDN18.2的表達分別取1×106個AGS、MGC803和MKN45細胞，加入300 μl添加有蛋白酶抑制劑的RIPA試劑，冰上裂解30 min，之后12 000 r/min離心取上清液，加入5×loading buffer并煮沸變性，之后以每孔30 μg蛋白量進行上樣，SDS-PAGE電泳后，使用200 mA轉膜條件轉膜90 min，將PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h，加入鼠抗人GAPDH抗體(1 ∶1 000)、兔抗人HER2抗體(1 ∶2 000)和兔抗人CLDN18.2抗體(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜，次日加入羊抗兔(1 ∶10 000)、羊抗鼠(1 ∶10 000)二抗，室溫孵育1 h，之后在曝光液孵育后進行曝光。

1.3 慢病毒感染法構建過表達CLDN18.2和HER2的AGS細胞系在6孔板中接種AGS細胞系，每孔3×105個，次日待細胞匯合度達到70%時，分別加入50 μl過表達CLDN18.2或(和)HER2的慢病毒，并加入終濃度為6 μg/ml的polybrene，在培養箱中培養12 h，更換新鮮的培養基，在感染3 d后加入1.5 μg/ml嘌呤霉素進行篩選培養，篩選5 d后即可得過表達CLDN18.2、過表達HER2以及同時過表達CLDN18.2和HER2的AGS細胞系，并分別命為C-AGS、H-AGS及CH-AGS。

1.4 慢病毒感染法構建CAR-T細胞采集健康志愿者的10 ml外周血，采血流程經新疆醫科大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準(審批號：20210375)，且患者簽署知情同意書。按照制造商的說明，使用Ficoll-Paque試劑利用密度梯度離心法獲得外周血單核細胞，之后按照制造商的說明使用CD3+T細胞分選磁珠分離得到CD3+T細胞。取3×106個T細胞，加入75 μl人CD3/CD28激活磁珠，培養48 h后，以1×106個T細胞為基準，分別加入Cz或(和)Hbb過表達慢病毒，并加入終濃度為8 μg/ml的polybrene，4 300 r/min離心60 min，靜置培養24 h后更換新鮮的培養基。培養3 d后使用流式細胞術檢測感染陽性率，CAR-T細胞結構分別命名為Cz、Hbb和CHbbz。

1.5 流式細胞術檢測慢病毒感染效率和T細胞亞型的比例分別取6×105個C-AGS、H-AGS及CH-AGS細胞，均分為2份，一份加入同型對照抗體，另一份加入5 μl的FITC-HER2和PE- CLDN18.2抗體，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗3次后，使用流式細胞儀進行分析。

分別取3×105個Cz、Hbb和CHbbz細胞，PBS清洗3次后，使用流式細胞儀檢測細胞中eGFP和mCherry的表達情況。

分別取3×105個Cz、Hbb和CHbbz細胞，加入5 μl的FITC-CD4和PE- CD8抗體，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗3次后，使用流式細胞儀進行檢測。所有數據使用Flowjo V10進行分析。

1.6 LDH法檢測CAR-T細胞對靶細胞的細胞毒性取1×104個MGC803、MKN45、AGS、C-AGS、H-AGS及CH-AGS細胞置于96孔板中，待細胞貼壁后，按照1 ∶3、1 ∶1及3 ∶1的效靶比分別加入未感染的T細胞(Untransduced)、Cz、Hbb和CHbbz細胞，共孵育24 h，2 600 r/min離心10 min，吸取上清液，按照制造商的說明書使用LDH細胞毒性檢測試劑盒檢測上清液中LDH的含量。細胞毒性的計算公式為：細胞毒性 (%)=(處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度)/(細胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度)×100%。

1.7 裸鼠移植瘤模型檢測CAR-T細胞的體內抑瘤效果6周齡左右的裸鼠(20 g左右)購自新疆醫科大學實驗動物中心，所有的動物實驗均通過新疆醫科大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準(審批號：20210397)，動物飼養在SPF環境中，自由進食飲水。

取5×106個CH-AGS細胞重懸于100 μl PBS中，接種于裸鼠背部皮下，待腫瘤長至80 mm3時，分別通過尾靜脈回輸1×107個Untransduced、Cz、Hbb和CHbbz細胞。

分別取5×106個AGS、C-AGS、H-AGS及CH-AGS細胞重懸于100 μl PBS中，接種于裸鼠背部皮下，待腫瘤長至80 mm3時，分別通過尾靜脈回輸1×107個CHbbz。回輸后每2 d檢測一次腫瘤體積，體積計算公式為：體積=瘤長(mm)×瘤寬(mm)2/2。待實驗結束后，剖出腫瘤，進行稱重。

1.8 免疫組化檢測腫瘤組織中CD3+T細胞的含量取50 mg新鮮的腫瘤組織，使用多聚甲醛固定液固定48 h，之后經過脫水包埋，將組織切成5 μm的薄片，脫蠟復水后滴加100 μl兔抗人CD3抗體(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜，次日滴加100 μl羊抗兔二抗(1 ∶1 000)，室溫孵育1 h后，使用DAB顯色液進行顯色，之后用蘇木精染液復染，蓋玻片封片后在顯微鏡下進行拍照觀察。

2 結果

2.1 胃癌細胞中CLDN18.2和HER2的表達Western blot(圖1A)以及流式細胞術(圖1B)檢測結果表明，胃癌細胞系MKN45和MGC803高表達CLDN18.2和HER2，然而AGS細胞系均不表達這兩種蛋白。此外，利用流式細胞術檢測慢病毒感染后的AGS細胞系，證明分別過表達CLDN18.2或HER2以及同時過表達CLDN18.2和HER2的AGS細胞系構建成功(圖1C)。

圖1 CLDN18.2和HER2在胃癌細胞中的表達A：Western blot檢測MKN45、AGS和MGC803中CLDN18.2和HER2的表達；B：流式細胞術檢測MKN45和MGC803中CLDN18.2和HER2的表達；C：流式細胞術分析工程化的AGS中CLDN18.2和HER2的表達

2.2 雙受體CAR-T細胞的構建以及表型分析兩種嵌合抗原受體的結構見圖2A所示。流式細胞術檢測結果表明，Cz的陽性率為 (98±0.5)%，Hbb的陽性率為(79±2.1)%，雙受體的CHbbz的陽性率為(64±1.3)%(圖2B)。同時檢測了各類CAR-T細胞中CD4+和CD8+T細胞的比例，流式細胞術檢測結果表明，各類CAR-T細胞中CD8+T細胞占比超過(80±3.8)%，具備良好的腫瘤殺傷潛力(圖2C、2D)。

圖2 不同工程化T細胞的性質A：Cz和Hbb的結構示意圖；B：流式細胞術檢測Cz、Hbb和CHbbz的陽性率；C：流式細胞術檢測工程化T細胞中CD8+的表型；D：流式細胞術檢測工程化T細胞中CD4+的表型

2.3 Cz和CHbbz在體外特異性殺傷CLDN18.2+及CLDN18.2+HER2+的腫瘤細胞將不同的CAR-T細胞分別與不同種類的腫瘤細胞共孵育，細胞毒性實驗結果表明，Cz和CHbbz對于靶細胞為CLDN18.2+的C-AGS及CLDN18.2+HER2+的CH-AGS、MGC803和MKN45均具有劑量依賴的殺傷活性，對于CLDN18.2-HER2-的AGS及CLDN18.2-HER2+的H-AGS則沒有細胞毒性，而Hbb對各種靶細胞均無細胞毒性(FC-AGS 1:1=13.72,FC-AGS 3:1=21.83,FCH-AGS 1:1=10.91,FCH-AGS 3:1=30.37,FMGC803 1:1=15.57,FMGC803 3:1=22.71,FMKN45 1:1=10.22,FMKN45 3:1=19.52，P<0.001),見圖3。

圖3 CAR-T細胞在指定效靶比條件下對不同腫瘤細胞的細胞毒性與Untransduced比較：***P<0.001

2.4 CHbbz可以有效抑制胃癌細胞CH-AGS的體內生長在接種有CH-AGS的裸鼠移植瘤模型中，只有回輸CHbbz的組別可以有效抑制胃癌細胞的生長，而回輸Cz和Hbb均不能抑制腫瘤生長(F=29.36,P<0.01；F=44.90，P<0.01)，見圖4A、4B。免疫組化結果表明，回輸CHbbz的腫瘤組織中CD3+T細胞產生浸潤，而回輸Cz和Hbb的腫瘤組織中幾乎沒有T細胞浸潤，見圖4C。

圖4 CAR-T細胞對胃癌細胞的體內抗腫瘤活性A：治療后CH-AGS腫瘤隨時間的瘤體積變化；B：治療結束后CH-AGS腫瘤的腫瘤質量；C：免疫組化法檢測腫瘤組織中CD3的表達 SP ×100；與Untransduced比較：**P<0.01

2.5 CHbbz僅對CLDN18.2+HER2+的腫瘤生長產生抑制作用分別建立接種AGS、H-AGS、C-AGS和CH-AGS的裸鼠移植瘤模型，回輸CHbbz后發現其僅對CLDN18.2+HER2+的CH-AGS的腫瘤產生抑制活性，而對其他三種腫瘤均不能抑制其生長(F=55.09,P<0.01；F=19.38，P<0.001)，見圖5A、5B。免疫組化結果表明，在接種CH-AGS的腫瘤組織中T細胞產生浸潤，而對于其他三種腫瘤組織中幾乎沒有T細胞浸潤，見圖5C。

圖5 CHbbz對CLDN18.2+ HER2+ 腫瘤細胞具有腫瘤抑制活性A：治療后各組腫瘤體積隨時間的變化；B：治療結束后各組的腫瘤質量；C：免疫組化法檢測腫瘤組織中CD3的表達 SP×100；與AGS比較：**P<0.01,***P<0.001

3 討論

嵌合抗原受體T細胞是一種很有前途的癌癥治療方法。然而，CAR-T細胞可能會因正常組織表達靶抗原而造成正常組織受損[10]。有報道稱，在回輸靶向CAIX的CAR-T細胞后，由于膽管上皮表達CAIX，造成了嚴重的肝臟毒性。更嚴重的，在靶向ErbB2的CAR-T細胞回輸后，已經觀察到涉及患者死亡的嚴重不良事件[11]。降低這種嚴重不良事件的一種方法是將CAR的胞內信號元件中的第一信號激活域和第二共刺激域物理隔離，將它們置于兩個不同的CAR中，這些CAR針對兩種不同的抗原，因此，這種靶向兩個抗原的CAR-T細胞與靶向單一抗原的CAR-T細胞相比脫靶概率會低得多。

本研究使用了兩種不同的CAR，分別靶向CLDN18.2和HER2，其中CLDN18.2負責調控CD3ζ信號，HER2負責調控4/1BB信號。之所以選擇這種組合策略，是由于CLDN18.2相較于HER2，其在胃癌中的表達特異性更強[8-9]，因此作為第一信號域的控制因素，可以進一步增強腫瘤特異性。在體外實驗中，當靶細胞只表達CLDN18.2或同時表達CLDN18.2和HER2時，Cz和CHbbz都發揮劑量依賴的細胞毒作用，且二者之間并無差異。造成這一結果的原因可能是在體外共孵育條件下，CAR-T細胞和靶細胞直接接觸，在較高的抗原密度下，CD3ζ信號足夠強烈，已經可以發揮較強的腫瘤殺傷效應，使得在短期的刺激過程中，Cz和CHbbz沒能表現出差異。但在體內研究中，CHbbz具有抗腫瘤活性，而Cz未能表現出足夠的腫瘤抑制活性，這可能是由于在體內研究中，沒有共刺激信號的Cz不能有效擴增，因此不能有效抑制腫瘤生長。同樣的，先前有研究[12]表明，CAR-T細胞在體內的抗腫瘤效果和其在體內的擴增以及持續時間相關。除此之外，體內研究顯示，CHbbz只有在腫瘤細胞同時表達CLDN18.2和HER2時才可以發揮腫瘤抑制活性，表明其發生脫靶的概率降低。

約50%的胃癌患者高表達HER2，是一個非常明確的胃癌靶標，已經有靶向HER2的ADC藥物獲FDA突破性藥物資格，用于治療胃癌[13]。CLDN18.2是CLDN-18的胃特異性亞型。CLDN18.2特異性人鼠嵌合單克隆抗體IMAB362的臨床數據顯示，其對正常組織無毒性作用，且對胃癌患者的總體客觀反應約為10%[13]。這些數據表明，CLDN18.2是一個非常有希望的治療胃癌的靶點。因此，以CLDN18.2和HER2為靶點的雙受體CAR-T細胞是一個非常理想的胃癌治療組合。

雙靶向CAR-T細胞的抗腫瘤能力較差，推測CAR-T細胞的雙靶向結構不是簡單地分離兩個信號域。一些未知因素也可能影響最終的治療效果。有研究[14]表明，scFv的結構可能影響下游信號及其最終的抗腫瘤活性。因此后續仍需要繼續優化雙CAR的結構，如更換scFv，來提高CHbbz的腫瘤抑制能力。此外，由于目前還沒有可以模擬人類CLDN18.2和HER2表達的轉基因小鼠模型，CHbbz的真實脫靶情形仍不能過早的下定論。本研究只能表明CLDN18.2和HER2特異性CAR-T細胞對單靶點組織的殺傷作用非常輕微，但真正的作用只能在未來的臨床試驗中得到證實。

總之，本研究表明靶向CLDN18.2和HER2的雙受體CAR-T細胞可以降低脫靶毒性發生的概率，并抑制胃癌的生長，是一種胃癌治療的潛在策略。