基于網絡藥理學和分子對接技術探討圣愈湯治療骨關節炎的作用機制

朱在師，趙啟剛，李西海

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種常見、多發、難治的慢性筋骨病，以滑膜炎癥、軟骨退變、軟骨下骨代謝異常為病理特征［1］。OA 屬于中醫“痹證”“痿證”范疇，OA 患者多因年老體衰、肝腎虧虛，引發氣血、筋骨失和，導致發病［2］。針對氣血失和是OA 的重要發病機制，臨床常用圣愈湯（出自《醫宗金鑒·刪補名醫方論》）調和氣血以治療OA［3-5］。但圣愈湯治療OA 的活性成分尚未明確，有待進一步研究，因此，本研究借助網絡藥理學技術和分子對接技術探討圣愈湯治療OA 可能的作用機制。

1 方 法

1.1 圣愈湯活性成分、藥物靶點篩選 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，篩選圣愈湯中黃芪、人參、熟地黃、白芍、川芎、當歸的活性成分，同時在該數據庫中檢索下載符合要求的活性成分對應的藥物靶點。

1.2 OA 差異基因的獲取 以“osteoarthritis”為檢索詞，在GEO 數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索OA 相關基因測序表達芯片，將得到的結果按條目類型項目選擇“Series”，研究類型項目選擇“Expression profilling by array”，物種項目選擇“Homo sapiens”進行篩選，篩選后選取差異顯著的GSE 55457、GSE 29746、GSE 51588 3 個 OA 芯片。通過 PERL 軟件利用log2 算法，對這3 個OA 芯片進行數據整理，獲取3 個芯片中的OA 差異基因。

1.3 活性成分-交集靶點調控網絡的構建及分析 利用PERL軟件將圣愈湯的藥物靶點分別與3個OA 芯片的OA 差異基因取交集，獲得3 個OA 芯片與圣愈湯藥物靶點的交集靶點，通過R 語言將3 個芯片的交集靶點取并集且去重，獲得圣愈湯治療OA 的交集靶點。將圣愈湯治療OA 的交集靶點及活性成分導入Cytoscape 3.8.1 軟件，繪制圣愈湯活性成分-交集靶點網絡圖，篩選度值從大到小排序前10 的成分作為圣愈湯治療OA 的主要活性成分。

1.4 交集靶點蛋白互作網絡（PPI）的構建與分析 將交集靶點導入 String 數據庫（https：//cn.string-db.org/），將物種設為“Homo Sapiens”，最低閾值設為≥0.4，進行PPI 分析。從String 數據庫導出分析所得數據并導入Cytoscape 3.8.1 軟件，繪制交集靶點PPI網絡圖，以中介中心性（BC）、接近中心性（CC）和節點數目（DC）三者大于各自中位數作為篩選條件，篩選2 次，保留符合條件的交集靶點作為圣愈湯治療OA 的關鍵靶點。

1.5 GO 生物學進程與KEGG 通路富集分析 使用R 語言中Bioconductor 插件，對交集靶點進行GO 的生物學過程（bilgical process，BP）、分子功能（mlecular functin，MF）、細胞組分（cell components，CC）以及KEGG 通路富集分析，以P＜0.05 為篩選條件，取矯正后P值排名前10 的生物學功能和排名前20 的信號通路進行分析。

1.6 分子對接驗證 利用PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org/）下載PPI 網絡篩選出的關鍵靶點的3D 結構，在 PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載關鍵靶點對應的活性成分結構；用PyMOL 2.4.1 軟件移除關鍵靶點受體結構中的水分子以及小分子配體，然后導入AutoDock Tools 1.5.6軟件，使對接位點選擇以原有配體為中心，設置網格箱（gird box）為默認值；最后利用AutoDock Vina軟件完成圣愈湯關鍵活性成分與核心靶點的對接，將對接結果輸出為txt 文件和pdbqt 文件，通過txt 文件查看兩者的最低結合能，用PyMOL 2.4.1打開pdbqt文件查看對接圖像；通過關鍵靶點和活性成分的分子對接結果來驗證網絡藥理學篩選結果。

2 結 果

2.1 圣愈湯活性成分及藥物靶點 共篩選出圣愈湯56 個活性成分，其中共有6 個重復活性成分，其余活性成分及靶點數量，見表1。

表1 圣愈湯活性成分及藥物靶點基本信息

2.2 OA 差異基因 在 GSE 55457、GSE 29746、GSE 51588 3 個 OA 芯片中，分別有 1 770、2 342、4 532 個OA 差異基因。

2.3 活性成分-交集靶點調控網絡的構建及分析 得到3 個芯片的26、39、54 個交集靶點，將3 芯片的交集靶點取并集且去重，獲得圣愈湯治療OA的98 個交集靶點。構建活性成分-交集靶點網絡圖，見圖1。篩選DC 值前10 的活性成分，見表2。

圖1 活性成分-交集靶點網絡圖

表2 圣愈湯主要活性成分相關信息

2.4 PPI 的構建與分析 構建交集靶點PPI 網絡圖，見圖2。篩選2 次并繪制新的PPI 網絡圖，篩選流程圖見圖3。排名前10 的關鍵靶點信息見表3。

圖2 交集靶點PPI 網絡圖

圖3 關鍵交集靶點篩選流程圖

表3 排名前10 的關鍵靶點信息

2.5 GO 與 KEGG 富集分析 GO 富集分析結果見圖4。結果顯示BP、MF、CC 主要富集于血管新生的調節、調節缺氧環境、促進炎癥反應對脂多糖等生物過程和氧化還原酶活性等分子功能上。KEGG富集結果，見圖5，結果顯示排名前20通路主要富集在IL-17、TNF、Toll 樣受體通路等進程上。

圖4 GO 富集分析結果氣泡圖

圖5 KEGG 富集分析結果

2.6 分子對接驗證 為進一步驗證圣愈湯治療OA 網絡預測結果，選取排名前3 的核心靶點與其對應活性成分做分子對接驗證，獲得活性成分與核心靶點分子對接自由能，見表4。結合自由能＜0 kcal/mol說明配體和受體可以自發結合，一般認為兩者結合自由能越低，發生作用的可能性越大。圣愈湯活性成分與核心靶點結合能均≤-5.0 kcal/mol，提示篩選出的核心靶點與其對應的活性成分具有良好的親和力。分子對接結果，見圖6。

圖6 核心靶點分子與槲皮素對接結果展示

表4 核心靶點結合化合物的結合能

3 討 論

OA 歸屬中醫“痹證”范疇，中醫學認為OA 病在筋骨，病位在肝、腎，以氣血失和為重要發病機制。肝主筋藏血，腎主骨藏精。若肝腎虧虛，氣血失和，則發為痹證，故治療OA 以調氣血、榮筋骨為治則［6］。圣愈湯出自《醫宗金鑒·刪補名醫方論》，由黃芪、人參、熟地黃、白芍、川芎、當歸組成，具有益氣、攝血、補血之功效。

本研究通過網絡藥理學探析圣愈湯治療OA的潛在作用機制。研究結果顯示：圣愈湯藥物中共有56 個活性成分，集中在黃芪、人參2 味中藥，槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇能匹配到較多的疾病靶點。槲皮素作為一種常見的黃酮類化合物，主要功能為抗氧化、抗炎及免疫，保護軟骨［7］；槲皮素還可通過p38 信號通路抑制巨噬細胞釋放促炎因子，并介導NF-κB 信號通路抑制炎癥反應［8］。山柰酚能增加成骨細胞活化因子RUNX-2、Osterix、BMP2、RHCgⅠ表達［9］，通過抗炎、抗氧化，改善 OA病理變化。β-谷甾醇在抗氧化、抗炎、免疫調節等方面有一定的作用，可通過調節TNF-α、IL-6、MMP-13相關信號通路，抑制炎癥反應，保護軟骨［10］。異鼠李素可抑制破骨細胞活性和軟骨細胞凋亡，從而避免軟骨損傷，以達到治療OA 的目的［11］。

PPI 分析結果提示白細胞介素-6（IL-6）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、基因金屬蛋白酶-9（MMP-9）、原癌基因（MYC）、轉錄因子AP-1（JUN）、環加氧酶 2（PTGS2）、缺氧誘導因子 1 亞基α（HIF-1α）、過氧化物酶體增生激活受體（PPARG）、熱休克蛋白90α 家族A 類成員1（HSP90AA1）、細胞周期蛋白D1（CCND1）是圣愈湯治療OA 的關鍵靶點。炎癥因子IL-6 受體在軟骨細胞中表達，在軟骨退變過程中發揮重要的調控作用。MMP-9 通過降解軟骨基質，引發軟骨退變，參與 OA 病理進程［12］。VEGFA 是血管內皮細胞生長因子VEGF 中最重要的亞型，其對血管內皮的增殖和分化的影響最大。研究表明，VEGF 的表達變化與滑膜炎癥、軟骨變性及軟骨細胞凋亡等過程密切相關［13］，同時可以促進MMP-1 及MMP-3 的表達，從而導致關節軟骨組織破壞［14］。

GO 富集分析結果顯示：圣愈湯治療OA 的生物學過程主要涉及脂多糖反應、血管新生調節、缺氧環境調節、氧化應激反應等，與炎癥的形成與發展、血管調節有著密切的聯系。KEGG 通路富集結果顯示：圣愈湯治療OA 的信號通路主要有AGERAGE 信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、IL-17 信號通路等，集中在炎癥反應、血管及細胞凋亡等方面。研究表明AGE-RAGE 可激活促炎因子的分泌，導致關節出現炎癥反應，同時可充當炎癥細胞因子來激活先天免疫細胞，推動OA 病情的發展［15-16］。LPS 又稱內毒素，可以激活 Toll 樣受體 4（TLR4），引起炎癥反應。TLR4 識別 LPS 后，招募下游信號分子觸發一系列的信號級聯反應，最終活化NF-κB，誘導促炎因子IL-1β 和TNF-α 等的表達［17］。IL-17 信號通路的主要功能在于促進炎性因子的釋放，能夠上調IL-6、TNF-α、IL-1β 等炎性因子的分泌，進而加重炎癥反應，導致軟骨出現不可逆轉的損傷；IL-17 還能抑制骨形態發生蛋白2誘導的成骨細胞分化參與骨重建的調控［18］。我們推測圣愈湯治療OA 可能與該通路及調節氣血有關，有待進一步認證。

將核心靶蛋白與槲皮素對接后獲得的結合能均遠小于參考值-5.0 kcal/mol，表明圣愈湯活性成分能與OA 核心靶點受體蛋白穩定結合，并發揮顯著作用，基于此得到的網絡分析結果可信度較高，參考價值較大。

綜上所述，本文揭示圣愈湯的活性成分與OA的靶點基因之間復雜調控網絡，提示圣愈湯治療OA 主要涉及的核心靶點包括IL-6、VEGFA、MMP9、MYC、JUN 等，靶點間作用關系復雜多樣，富集到多條通路，涉及了炎癥、血管生成、免疫等多個方面。提示圣愈湯可能通過調節炎癥反應、血管生成、免疫反應和細胞凋亡等方面治療OA。為進一步驗證網絡藥理學結果，后續可開展相應基礎實驗進行驗證。