心肌肌球蛋白結合蛋白C在急性心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷模型豬中的表達及意義

馬國鈐，楊茂東，劉演龍，張婭妮，馮亮，張毅恒，戴海龍，尹小龍

有報告指出，2002—2017年我國急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）死亡率總體呈上升態勢［1］。心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）是診斷AMI的重要指標，但其在AMI患者發病后4～6 h才開始升高，對癥狀不典型患者可能會延遲診斷［2］。因此，迫切需要一種能夠在發病早期就確定心肌梗死及其嚴重程度的生物標志物。此外，目前缺乏有力的心肌缺血再灌注損傷早期生物標志物。近年來有學者開始探尋新的心肌標志物，包括心臟型脂肪酸結合蛋白（hearttype fatty acid-binding protein，H-FABP）、心肌肌球蛋白結合蛋白C（cardiac myosin binding protein-C，cMyBP-C）等［3-4］。目前大多數研究集中在心臟亞型的調控上，且發現編碼cMyBP-C的MYBPC3基因的兩種突變類型被證明可導致肥厚型心肌病，這表明cMyBP-C可能在心臟疾病的發生發展過程中發揮了重要作用［5-6］。研究指出，cMyBP-C可以維持心臟的正常結構和功能，有望成為早期診斷AMI的新型標志物［7］。本實驗通過外科開胸結扎滇南小耳豬左前降支（left anterior descending，LAD）以建立AMI、心肌缺血再灌注損傷動物模型，并定時采血，檢測不同時間點cTnI、cMyBP-C水平，分析cMyBP-C在AMI、心肌缺血再灌注損傷模型豬中的表達及意義，以期為確定AMI及心肌缺血再灌注損傷早期生物標志物提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2020年6—12月。

1.2 實驗動物 9頭試驗用滇南小耳豬由云南農業大學提供〔SYXK（滇）K2020-005〕，雌雄不限，體質量30～40 kg。清潔環境適應性飼養1周，12 h光照/黑暗交替，溫度（25±1）℃、相對濕度（65±5）%。

1.3 主要實驗儀器與試劑 丙泊酚乳狀注射液（江蘇恩華藥業股份有限公司），4%多聚甲醛固定液及豬cMyBP-C、cTnI酶聯免疫吸附試驗試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及干預方法 將試驗用滇南小耳豬隨機分為假手術組（開胸后打開心包，不結扎冠狀動脈，n=1）、AMI組（開胸后打開心包，結扎LAD中遠段血管，n=4）、心肌缺血再灌注損傷組（開胸后打開心包，結扎LAD中遠段血管3 h后再開放，n=4）。假手術組通過穿刺耳緣靜脈注射丙泊酚乳狀注射液10 ml（20 ml∶0.2 g）或使用呼吸麻醉機連接獸用面罩使滇南小耳豬吸入異氟烷進行全身麻醉，監測滇南小耳豬心率及心電圖，開胸后打開心包，不結扎冠狀動脈，10 min后逐層縫合胸腔。AMI組術前準備、麻醉方法及開胸操作同假手術組，開胸后打開心包，明確血管走行后選擇LAD中遠段（距LAD遠端1/4～1/3處）為結扎位點，結扎血管；觀察30 min后取下撐開器，逐層縫合胸腔。造模成功標準：結扎部位心肌蒼白或發紺，心電圖顯示ST段持續抬高、T波高尖。心肌缺血再灌注損傷組術前準備、麻醉方法、開胸操作及結扎方法同AMI組，結扎血管并觀察30 min后取下撐開器，閉合胸腔，3 h后再次用撐開器打開胸腔并取下結扎LAD中遠段血管的縫線，結扎血管迅速充盈，心臟腫脹減輕，顏色迅速由暗紅色恢復至正常，再次觀察30 min后取下撐開器，逐層縫合胸腔。造模成功標準：結扎LAD中遠段血管后符合AMI造模成功標準，取下結扎LAD中遠段血管的縫線后，結扎部位心肌蒼白或發紺減輕，心電圖顯示ST段回落。

1.4.2 心率及心電圖表現 記錄各組滇南小耳豬手術前后心率及心電圖表現。

1.4.3 術后心臟組織病理切片 最后一次成功采血后，處死各組滇南小耳豬，再次開胸取下心臟，放入4%多聚甲醛固定液中固定24 h后進行石蠟固定、包埋并切片，進行HE染色，于光學顯微鏡下觀察各組滇南小耳豬術后心臟組織病理切片。

1.4.4 cTnI、cMyBP-C水平檢測 分別于術前及術后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、18.0、24.0 h采集假手術組、AMI組滇南小耳豬股靜脈血10 ml（假手術組打開心包10 min后開始計時取血，AMI組結扎LAD中遠段血管后開始計時取血），分別于術前和術后0.5、1.0、2.0、3.0、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、9.5、11.5、13.5、15.5、21.5、27.5 h采集心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬股靜脈血10 ml（結扎LAD中遠段血管后開始計時取血），采用酶聯免疫吸附試驗檢測cTnI、cMyBP-C水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，組內不同時間點cTnI、cMyBP-C水平比較采用單因素重復測量方差分析，組內兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 假手術組無死亡發生；AMI組1頭滇南小耳豬于結扎LAD中遠段血管后0.5 h死于頑固性室性心律失常；心肌缺血再灌注損傷組1頭滇南小耳豬于結扎LAD中遠段血管后0.5 h死于頑固性室性心律失常，1頭滇南小耳豬于開放LAD中遠段血管后14 h死于緩慢性心律失常。

2.2 心率及心電圖表現 假手術組滇南小耳豬術前心率正常，節律規整，無ST段抬高，術后心率較術前增快；AMI組、心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬結扎LAD中遠段血管后開始出現心率加快，T波高尖、倒置，ST段抬高等ST-T段動態改變；心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬開放LAD中遠段血管后心率仍較快，ST段回落，T波倒置，見圖1。

圖1 各組滇南小耳豬手術前后心電圖檢查結果Figure 1 Electrocardiographic examination results of Diannan small ear pigs in each group before and after operation

2.3 術后心臟組織病理切片 術后心臟組織病理切片顯示，假手術組心肌組織結構完整、心肌纖維條路清晰，細胞排列整齊規則、形態正常；AMI組及心肌缺血再灌注損傷組部分心肌纖維斷裂及心肌細胞核溶解消失，細胞空泡樣改變，大量炎癥細胞浸潤，見圖2。

圖2 各組滇南小耳豬術后心臟組織病理切片（HE染色）Figure 2 Cardiac histopathological sections of Diannan small ear pigs in each group after operation

2.4 cTnI、cMyBP-C水平 假手術組手術前后cTnI、cMyBP-C水平無明顯變化，見表1。

表1 假手術組滇南小耳豬不同時間點cTnI、cMyBP-C水平（n=1）Table 1 Levels of cTnI and cMyBP-C at different time points in Diannan small ear pigs in the Sham group

AMI組滇南小耳豬不同時間點cTnI、cMyBP-C水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；AMI組滇南小耳豬術后6.0、8.0、10.0、12.0、18.0、24.0 h cTnI水平高于術前，術后1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h cMyBP-C水平高于術前，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。AMI組滇南小耳豬cTnI水平術前到術后4.0 h基本穩定，術后6.0 h開始逐漸升高，直至術后24.0 h；AMI組滇南小耳豬cMyBP-C水平術后1.0 h開始逐漸升高，術后6.0 h達高峰，之后逐漸降低。

表2 AMI組滇南小耳豬不同時間點cTnI、cMyBP-C水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of cTnI and cMyBP-C levels at different time points in Diannan small ear pigs in the AMI group

表2 AMI組滇南小耳豬不同時間點cTnI、cMyBP-C水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of cTnI and cMyBP-C levels at different time points in Diannan small ear pigs in the AMI group

注：a表示與術前比較，P＜0.05

時間 cTnI（pg/ml） cMyBP-C（ng/ml）術前 650.98±15.22 13.63±0.31術后0.5 h 638.42±7.53 14.19±0.15術后1.0 h 649.97±14.63 16.54±0.28a術后2.0 h 655.50±25.63 18.99±0.24a術后3.0 h 700.19±30.58 22.52±0.53a術后4.0 h 701.20±24.03 25.86±1.10a術后6.0 h 1 173.27±55.78a 34.19±0.47a術后8.0 h 1 273.20±41.43a 29.68±0.64a術后10.0 h 1 356.67±16.80a 23.59±0.39a術后12.0 h 1 444.45±19.23a 17.07±0.59a術后18.0 h 1 586.07±35.53a 13.76±0.22術后24.0 h 1 728.70±17.59a 13.29±0.15 F值 785.185 541.905 P值 ＜0.001 ＜0.001

心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬不同時間點cTnI、cMyBP-C水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬術后5.5、6.5、7.5、9.5、11.5、13.5、15.5、21.5、27.5 h cTnI水平高于術前，術后1.0、2.0、3.0、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、9.5、11.5 h cMyBP-C水平高于術前，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬cTnI水平術前至術后4.5 h基本穩定，術后5.5 h開始逐漸升高，術后21.5 h達高峰，術后27.5 h略有下降；心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬cMyBP-C水平術后1.0 h開始逐漸升高，術后4.5 h達高峰，之后逐漸下降，至術后13.5 h趨于穩定。

表3 心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬不同時間點cTnI、cMyBP-C水平比較（±s，n=2）Table 3 Comparison of cTnI and cMyBP-C levels at different time points in Diannan small ear pigs in the myocardial ischemia reperfusion injury group

表3 心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬不同時間點cTnI、cMyBP-C水平比較（±s，n=2）Table 3 Comparison of cTnI and cMyBP-C levels at different time points in Diannan small ear pigs in the myocardial ischemia reperfusion injury group

注：a表示與術前比較，P＜0.05

時間 cTnI（pg/ml） cMyBP-C（ng/ml）術前 656.00±10.69 13.62±0.15術后0.5 h 659.52±12.05 13.68±0.37術后1.0 h 666.55±5.29 17.02±0.38a術后2.0 h 677.59±21.09 19.12±0.30a術后3.0 h 659.01±8.57 21.51±0.24a術后3.5 h 675.08±22.67 23.70±0.22a術后4.5 h 675.59±9.80 25.89±0.44a術后5.5 h 785.57±10.03a 23.56±0.29a術后6.5 h 901.58±9.69a 21.57±0.31a術后7.5 h 1 025.62±14.37a 18.98±0.28a術后9.5 h 1 161.72±10.58a 16.37±0.33a術后11.5 h 1 238.55±18.72a 14.70±0.22a術后13.5 h 1 341.50±15.97a 13.68±0.10術后15.5 h 1 402.77±19.08a 13.70±0.15術后21.5 h 1 436.92±8.53a 13.52±0.23術后27.5 h 1 406.04±11.72a 13.61±0.05 F值 1 633.985 658.259 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

AMI已成為導致全球人類死亡的主要疾病之一，全世界有80%以上的人死于心血管疾病［8］。AMI是由不穩定斑塊形成的血栓突然阻塞冠狀動脈管腔，進而導致心肌缺血壞死。由于心肌細胞屬于不可再生細胞，一旦發生缺血壞死就只能由纖維細胞及瘢痕組織代替壞死心肌，如果心肌細胞壞死過多，可能進一步影響心臟收縮、射血功能，造成心功能不全。心肌缺血時，再灌注可能會再次導致心肌細胞損傷，增加梗死面積，同時還會引起心律失常，因此及早判斷是否發生了心肌缺血再灌注損傷尤為重要［9-10］。由于豬的心臟在解剖結構、冠狀動脈側支循環稀疏、缺乏心肌黃嘌呤氧化酶活性等重要方面與人類心臟高度相似［11-14］，因此本研究選擇滇南小耳豬作為實驗動物并建立AMI及心肌缺血再灌注損傷動物模型。本研究結果顯示，假手術組滇南小耳豬手術前心率正常，節律規整，無ST段抬高，術后心率較術前增快；AMI組、心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬結扎LAD中遠段血管后開始出現心率加快，T波高尖、倒置，ST段抬高等ST-T段動態改變；心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬開放LAD中遠段血管后心率仍較快，ST段回落，T波倒置；術后心臟組織病理切片顯示，假手術組可觀察到心肌組織結構完整、心肌纖維條路清晰，細胞排列整齊規則、形態正常；AMI組及心肌缺血再灌注損傷組均可觀察到部分心肌纖維斷裂及心肌細胞核溶解消失，細胞空泡樣改變，大量炎癥細胞浸潤；證實本研究中的AMI模型及心肌缺血再灌注損傷模型建立成功。

cTnI多年來一直被視為診斷AMI的“金標準”，但其無法對患者早期再灌注治療起到很好的指導作用［15］。cMyBP-C主要存在三種亞型，即快骨骼肌型、慢骨骼肌型和心臟型，其中心臟型cMyBP-C是心臟肌節的基本組成部分，因其僅存在于心肌細胞而具有心臟特異性。cMyBP-C主要依賴翻譯后修飾和蛋白間的相互作用及通過磷酸化、谷胱甘肽化和乙酰化等來調節自身的功能，提示cMyBP-C可調節心功能，其可能是治療心臟疾病的新靶點［7，16-21］。WATKINS等［5］、BONNE等［6］發現，編碼cMyBP-C的MYBPC3基因的兩種突變類型可導致肥厚型心肌病，且通過對cMyBP-C結構、功能及翻譯修飾等方面研究發現其在作為早期診斷AMI的新型生物標志物方面具有巨大潛力及臨床價值。本研究結果顯示，AMI組滇南小耳豬術后6.0、8.0、10.0、12.0、18.0、24.0 h cTnI水平高于術前，術后1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h cMyBP-C水平高于術前；AMI組滇南小耳豬cTnI水平術前到術后4.0 h基本穩定，術后6.0 h開始逐漸升高，直至術后24.0 h；AMI組滇南小耳豬cMyBP-C水平術后1.0 h開始逐漸升高，術后6.0 h達高峰，之后逐漸降低；提示發生AMI后，cMyBP-C水平升高早于cTnI，其可能更有利于AMI的早期診斷。GOVINDAN等［22］納入了16例心肌梗死患者和11例健康對照者，結果顯示，心肌梗死患者血漿cMyBP-C明顯高于健康對照者。KAIER等［23］研究顯示，cMyBP-C對AMI的診斷能力優于高敏感性心肌肌鈣蛋白（high-sensitivity cardiac troponin，hs-cTn）（AUC分別為0.839、0.813，P＜0.01）；患者出現AMI癥狀2 h時的cMyBP-C診斷AMI的靈敏度、陰性預測值均為100%，說明cMyBP-C對AMI的診斷價值較高，可用于AMI患者的早期診斷。KUSTER等［24］為證實cMyBP-C作為AMI的超早期生物標志物的可行性，研究AMI模型豬血液中cMyBP-C水平變化情況，結果顯示，cMyBP-C在結扎冠狀動脈后3 h開始升高，并在6 h達到峰值，而cTnI于結扎冠狀動脈后6 h開始升高，提示cMyBP-C在心臟受損后會迅速釋放到血液中，可為早期診斷AMI提供幫助。研究顯示，心臟應激可引起cMyBP-C降解，并產生40 kDa的氨基末端片段，cMyBP-C不附著在肌絲上，更容易從心肌細胞釋放到循環血中，這為cMyBP-C早期診斷AMI提供了理論支持［22］。

目前心肌缺血再灌注損傷的診斷主要依賴溶栓后90 min冠狀動脈造影，而缺乏有力的早期生物標志物。本研究結果顯示，心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬術后5.5、6.5、7.5、9.5、11.5、13.5、15.5、21.5、27.5 h cTnI水平高于術前，術后1.0、2.0、3.0、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、9.5、11.5 h cMyBP-C水平高于術前；心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬cTnI水平術前至術后4.5 h基本穩定，術后5.5 h開始逐漸升高，術后21.5 h達高峰，術后27.5 h略有下降；心肌缺血再灌注損傷組滇南小耳豬cMyBP-C水平術后1.0 h開始逐漸升高，術后4.5 h達高峰，之后逐漸下降，至術后13.5 h趨于穩定；提示發生心肌缺血再灌注損傷后，cMyBP-C水平升高早于cTnI，其可能更有利于心肌缺血再灌注損傷的早期診斷。DECKER等［25］通過建立犬的心肌缺血再灌注損傷模型發現，缺血可導致cMyBP-C的去磷酸化，隨后的再灌注可促進肌原纖維釋放去磷酸化的cMyBP-C，并激活細胞質中cMyBP-C的蛋白水解。

目前cMyBP-C在人及其他動物體內釋放及清除的機制尚未明確，但其似乎比cTnI釋放更快、清除得也更快。發生AMI、心肌缺血再灌注損傷后，cMyBP-C水平升高早于cTnI的可能原因為，心肌缺血狀態下導致cMyBP-C去磷酸化，而cMyBP-C去磷酸化后容易水解，且再灌注后會激活細胞質中cMyBP-C的蛋白水解，從而加快cMyBP-C的釋放速度［25］。但有研究表明，在非缺血性心肌病的末期衰竭心臟中也可發現cMyBP-C的降解［26-27］，這提示其他形式的心臟應激或心肌損傷也可能導致cMyBP-C的降解和釋放。

綜上所述，cMyBP-C水平在AMI及心肌缺血再灌注損傷早期即明顯升高，且其升高早于cTnI，其有巨大潛力成為早期診斷AMI、心肌缺血再灌注損傷的生物標志物。但本研究樣本量過小，需要進行更大樣本量的隊列研究來進一步證實本研究結論。

作者貢獻：戴海龍、尹小龍進行文章的構思與設計，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理；尹小龍進行研究的實施與可行性分析；馮亮、張毅恒進行數據收集、數據整理及統計學處理；馬國鈐、尹小龍進行結果的分析與解釋；馬國鈐撰寫論文；馬國鈐、楊茂東、劉演龍、張婭妮進行論文的修訂。

本文無利益沖突。