慢性萎縮性胃炎患者胃黏膜組織中TFF2、miR-181a、RKIP的表達及相關性研究

李 霞，楊 云，王慧緯，王丙信

中國人民解放軍陸軍第八十一集團軍醫院消化內科，河北張家口 075000

慢性萎縮性胃炎(CAG)是一種與幽門螺桿菌(Hp)感染密切相關的疾病，會造成胃黏膜上皮和腺體萎縮，黏膜肌層增厚及腸上皮化生、不典型增生等，同時，作為癌前病變，它最終可能導致胃癌的發生[1-4]。為此，對CAG的精準診斷有著非常重要的意義。多種生物標志物的表達都與CAG相關，比如，三葉因子2(TFF2)、miR-181a和Raf激酶抑制蛋白(RKIP)等，它們在CAG向胃癌的發展過程中起保護胃黏膜和抑制腫瘤的作用[5-7]。但是，以往研究僅淺顯地對CAG患者的上述生物標志物的表達水平進行了分析，未進行與患者臨床特征的關系研究。因此，本研究采用回顧性分析方法，深入研究了TFF2、miR-181a和RKIP在CAG患者胃黏膜組織中的表達，并對3項指標與患者臨床特征的關系進行了研究，以期為CAG的診療提供新的手段。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2021年3月于本院進行胃鏡檢查的115例CAG患者為CAG組，均按《中國慢性胃炎共識意見》[8]標準，并經過胃鏡檢查和組織病理活檢確診，其中男60例，女55例。同期在本院進行胃鏡檢查的體檢健康者120例作為健康對照組，其中男63例，女57例。納入標準：(1)有完善的臨床資料；(2)近1個月內未服用過可能會對本研究試驗結果產生影響的藥物；(3)無胃部相關損傷，適合做胃鏡檢查；(4)無其他器官及免疫系統功能異常；(5)無任何其他可能會影響試驗結果或不適合進行相關試驗的因素。排除標準：(1)合并胃黏膜糜爛、胃出血、消化性潰瘍等；(2)合并心腦血管或其他器質性疾病；(3)合并胃癌等腫瘤。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署了知情同意書。

1.2儀器與試劑 所用儀器主要包括移液器(美國賽默飛公司)、烘箱(德國德菲瑞斯公司)、石蠟切片機(德國徠卡公司)、攤片機(東莞科迪儀器有限公司)、IMS圖像分析系統(德國徠卡公司)、光學顯微鏡(德國徠卡公司)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)儀(美國賽默飛公司)、高壓滅菌鍋(美國施都凱公司)、超低溫冰箱(青島海爾公司)、分光光度計(美國賽默飛公司)、高速離心機(美國賽默飛公司)。所用試劑主要包括兔抗人TFF2多克隆抗體(美國SAB公司)、兔抗人RKIP抗體(北京義翹神州科技有限公司)、SP免疫組化試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，1X磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)、Trizol試劑盒(北京酷來博科技有限公司)、RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、mRNA反轉錄試劑盒(美國EZBioscience公司)、綠色熒光RNA定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、內參基因U6(湖北百奧斯生物科技有限公司)、miR-181a引物(北京擎科生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集 在胃鏡檢查過程中，采用活檢鉗采集研究對象的胃黏膜組織標本。

1.3.2免疫組化法檢測TFF2和RKIP的表達水平 取受試者胃黏膜組織后，首先采用PBS沖洗，然后經過多聚甲醛固定、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5 μm切片、貼片、烤片等一系列步驟，制成石蠟切片。隨后，嚴格按照SP免疫組化試劑盒使用說明書進行免疫組化相關試驗。每例研究對象選擇5個×400視野，應用IMS圖像分析系統采集光密度值，取這5個視野的平均值作為免疫組化法檢測結果。

1.3.3RT-PCR檢測miR-181a表達水平 RT-PCR檢測參考LUO等[9]的方法并進行了適當改動。按Trizol試劑盒的說明書進行RNA的提取，采用紫外分光光度計測定RNA濃度及純度，嚴格按照試劑盒說明書內容進行反轉錄，最終合成cDNA。隨后，按照RNA熒光定量試劑盒使用說明進行RT-PCR。引物序列：miR-181a正向引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCAC-3′，反向引物為5′-ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGT CG-3′；β-actin正向引物序列為5′-TCGATCGATGCTAGCTAT-3′，反向引物為5′-TAGCATAGCTA GCTAGCT-3′；產物長度為135 bp。反應條件：95 ℃ 6 min預變性；95 ℃ 10 s變性；60 ℃ 15 s退火；72 ℃ 30 s延伸；50個循環。反應完成后，分析熔解曲線，以β-actin作為內參照，利用2—ΔΔCt計算miR-181a表達水平。

1.4觀察指標 (1)利用IMS圖像分析系統采集的TFF2和RKIP的光密度值；(2)利用2—ΔΔCt計算的miR-181a的表達水平。

2 結 果

2.1兩組基線資料比較 兩組研究對象性別及居住地比例、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。CAG組有飲酒史、吸煙史比例高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 患者基線資料對比

2.2兩組TFF2、RKIP和miR-181a表達水平比較 與健康對照組比較，CAG組的TFF2和miR-181a表達水平升高，RKIP表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。

2.3不同特征的CAG患者TFF2、RKIP和miR-181a表達水平比較 不同發病部位、幽門螺桿菌(Hp)感染史、胃炎/胃癌家族史、飲食習慣規律情況CAG患者間的TFF2、RKIP和miR-181a表達水平不同，差異有統計學意義(P<0.05)。以胃竇為主的CAG、全胃CAG患者TFF2表達水平低于以胃體為主的CAG患者(P<0.05)；miR-181a表達水平在以胃竇為主的CAG、以胃體為主的CAG、全胃CAG中依次升高(P<0.05)；RKIP表達水平在以胃竇為主的CAG、以胃體為主的CAG、全胃CAG中依次降低(P<0.05)。不同年齡、性別、胃炎/胃癌家族史情況CAG患者間TFF2、RKIP和miR-181a表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 兩組TFF2、RKIP和miR-181a表達水平比較

2.4TFF2、miR-181a與RKIP表達水平之間的相關分析 TFF2表達水平與miR-181a表達水平呈正相關(r=0.345，P=0.045)，TFF2、miR-181a表達水平與RKIP表達水平均呈負相關(r=—0.326，P=0.047；r=—0.625，P=0.008)。

2.5Logistic回歸分析影響CAG發生的風險因素 Logistic回歸分析發現，年齡≥50歲、發病部位以胃竇為主、Hp感染、有胃炎/胃癌家族史、飲食習慣不規律均為影響CAG發生的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

注：A為TFF2在健康對照組中低表達；B為TFF2在CAG組中高表達；C為RKIP在健康對照組中高表達；D為RKIP在CAG組中低表達。

表3 不同特征的CAG患者TFF2、RKIP和miR-181a表達水平比較

表4 Logistic回歸分析影響CAG的風險因素

3 討 論

CAG是一種以胃黏膜萎縮等為主要臨床特點的胃部疾病，發病機制復雜，與Hp感染、免疫、年齡、飲食習慣和遺傳因素等息息相關，如不給予適度的關注，易發展成為胃癌，進而危及患者的生命[9-11]。本研究結果顯示，健康對照組和CAG組有飲酒史和吸煙史比例比較，差異有統計學意義(P<0.05)，提示吸煙和飲酒可能是CAG發生的影響因素。

TFF2是三葉因子家族的一員，三葉因子家族成員還包括TFF1和TFF3。其中，TFF2可通過在胃部和十二指腸等消化器官中進行特異性表達，通過抑制胃酸的分泌，與黏液蛋白結合等降低胃黏膜可能受到的傷害，并與表皮生長因子和轉化生長因子協同作用，實現對胃黏膜的保護和修復[12]。生理情況下，TFF2主要來自于胃竇并表達于細胞質[13]。本研究結果顯示，TFF2表達水平在有Hp感染史、胃炎/胃癌家族史患者中升高，表明TFF2表達水平升高可能伴隨著CAG的發展進程。同時，以胃竇為主的CAG和全胃CAG患者的TFF2表達水平低于以胃體為主的CAG患者(P<0.05)，胃竇部位的功能損傷可能會抑制TFF2的表達，從而使胃部逐漸喪失自我保護功能。除此之外，規律的飲食習慣也可對CAG產生重要影響，且應減少過熱、過咸及辛辣食物的食用。miR-181a與細胞的多種功能都有聯系，比如，在胃炎的發展中，miR-181a表達水平與多種因素有關，可以作為反映病情的參考指標[14]。又比如，miR-181a在癌癥的發病機制中，既可以作為癌基因的誘導因素，又可以通過對癌基因進行抑制，從而限制腫瘤的發展[15-18]。本研究發現，不同發病部位、Hp感染史、胃炎/胃癌家族史、飲食習慣規律情況的CAG患者間miR-181a表達水平不同，差異有統計學意義(P<0.05)。CAG是發生胃癌的前兆，因此，miR-181a的表達水平升高很可能預示著患者癌癥風險的逐步增大。RKIP是一種小分子保守蛋白，能夠調節信號通路，對ERK信號進行負調控[19]。RKIP在人體的廣泛表達可以有效抑制癌細胞的生長和轉移[20]。TFF2表達水平與RKIP表達水平呈負相關(r=-0.326，P=0.047)，表明胃黏膜組織隨著病情的惡化，對癌細胞的抑制力也在逐漸降低。miR-181a的高表達和RKIP的低表達，協同增加了CAG向胃癌轉變的風險。

許多研究者對上述生物標志物在CAG中的表達水平進行了相關研究，例如，XU 等[21]、FOX等[22]及文娜等[12]發現，TFF2在CAG組織中的表達水平明顯升高，且其表達水平與胃癌前病變的病理嚴重程度密切相關。許辰等[14]探究了miR-181a的表達水平與CAG患者的病情及預后之間的關系，發現miR-181a在CAG組織中的表達水平上調，且其表達水平與患者腸化生等臨床病理參數及預后相關。吳紅艷等[23]發現CAG患者的RKIP表達水平降低，RKIP有望作為CAG的一種診斷指標。以上研究結果發現，TFF2、RKIP、miR-181a表達水平與CAG患者的病情關系密切,可作為預測胃癌發生、發展及判斷預后的潛在生物標志物。本研究通過Logistic回歸分析發現，年齡≥50歲、發病部位以胃竇為主、Hp感染、有胃炎/胃癌家族史、飲食習慣不規律均為影響CAG發生的獨立危險因素(P<0.05)，若患者具有以上因素中的任何一種，均需要對其加強隨訪，并予以積極治療，這對促進患者康復并降低癌變風險意義重大。

綜上所述，TFF2、RKIP和miR-181a表達水平在CAG患者的胃黏膜組織中升高，應對年齡≥50歲、發病部位以胃竇為主、有Hp感染、有胃炎/胃癌家族史、飲食習慣不規律患者加強隨訪。