動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的研究現(xiàn)況及特點(diǎn)

王琴琛 魏 蝶 朱配瑤 陳 茵 徐 漫 陳雪嬌

湖北文理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 湖北襄陽 441053

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種對(duì)人類生命健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害的疾病，是我國冠狀動(dòng)脈血栓形成和缺血性卒中最常見的發(fā)病原因。其特點(diǎn)是病變從受累動(dòng)脈的內(nèi)膜開始，逐漸引起脂質(zhì)積聚、纖維組織增生和鈣質(zhì)沉著，甚至導(dǎo)致動(dòng)脈中層的鈣化，繼而在此基礎(chǔ)上發(fā)生斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂以及局部血栓形成，這是大部分心血管疾病的主要病因。而血小板活化乃至動(dòng)脈血栓形成是造成AS病人血流阻塞的關(guān)鍵始動(dòng)環(huán)節(jié)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和生活水平的改善，人類對(duì)心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展、治療對(duì)策以及藥物研發(fā)的關(guān)注度日益增高。因此，建立可靠有效的AS血栓動(dòng)物模型成為該疾病研究的重要技術(shù)手段。本文通過對(duì)目前現(xiàn)有動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀以及不同動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)，以期為動(dòng)脈血栓疾病發(fā)病機(jī)制和新型抗栓藥物研發(fā)提供潛在藥物靶點(diǎn)和前期研究基礎(chǔ)。

1 嚙齒類模型

目前動(dòng)脈粥樣硬化血栓研究中，嚙齒類是應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物模型。該類動(dòng)物體型小、繁殖速度快，目前主要有小鼠、大鼠以及豚鼠用于動(dòng)脈粥樣硬化的研究。

1.1 小鼠模型

小鼠動(dòng)脈粥樣硬化常發(fā)生于主動(dòng)脈根部、主動(dòng)脈弓和頭臂干，而人類則主要發(fā)生在冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈等部位。小鼠模型具有體型小、繁殖迅速、易于培育、模型建立成本低以及操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。缺乏ApoE或LDL受體(LDLR)可誘發(fā)不基于HDL的高膽固醇血癥，這是小鼠模型動(dòng)脈粥樣硬化形成的基礎(chǔ)。通過建立不同小鼠模型，我們對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成機(jī)制的理解更為深刻，但小鼠模型并不能作為評(píng)估人類疾病的確切模型。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷進(jìn)步，載脂蛋白E缺乏小鼠(ApoE)模型與低密度脂蛋白受體敲除小鼠(LDL)模型成為目前應(yīng)用較為廣泛的兩種模型。ApoE小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊主要在主動(dòng)脈根部、主要分支等部位形成，這與人類極其相似的。且該模型具有動(dòng)脈粥樣硬化病變的全譜系，故可能是應(yīng)用最廣泛的模型，但其局限性也是不容忽略的。載脂蛋白E缺乏小鼠模型VLDL的含量最豐富，而人類最常見的主要為LDL。此外，載脂蛋白E影響著體內(nèi)多種功能，而這些與ApoE小鼠模型動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成息息相關(guān)，與血脂水平卻不相關(guān)。(LDL)小鼠模型中形成的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊與ApoE小鼠是相同的，但在不同飲食的誘導(dǎo)下，會(huì)產(chǎn)生更嚴(yán)重的病變。

1.2 大鼠模型

大鼠具有體型適中、抵抗力強(qiáng)、飲食結(jié)構(gòu)與人相近等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)而成為較理想的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。目前大鼠模型主要用于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的探討以及模型的建立，但大鼠飲食誘導(dǎo)性高脂血癥特征并不穩(wěn)定，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展還有一定的抵抗作用。目前出現(xiàn)了許多基因構(gòu)建大鼠模型，運(yùn)用同源重組技術(shù)構(gòu)建胚胎干細(xì)胞特異性敲除大鼠模型，結(jié)果顯示部分基因在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中是具有一定功能的。通過大鼠胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不易獲得有遺傳性的該細(xì)胞，這是該模型構(gòu)建過程中最大的困難。

1.3 豚鼠模型

與大鼠相比，豚鼠對(duì)飲食中膽固醇的變化更為敏感，少量的膽固醇即可引起明顯的高膽固醇血癥。經(jīng)高脂飲食模式誘導(dǎo)，主動(dòng)脈壁形成脂質(zhì)斑塊，內(nèi)膜增厚且炎癥細(xì)胞增多，出現(xiàn)泡沫細(xì)胞以及纖維斑塊等嚴(yán)重病變。但經(jīng)高膽固醇飲食誘導(dǎo)，豚鼠免疫力降低，早期炎性反應(yīng)無法觀察。豚鼠體內(nèi)含LDL-C、HDL-C以及VLDL-C，這與人體組成是很接近的。游離膽固醇是人類和豚鼠體內(nèi)主要的肝臟膽固醇，豚鼠肝臟的ACAT活性增高可促進(jìn)脂質(zhì)沉積。而豚鼠CETP含量的增高也進(jìn)一步促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。豚鼠病變部位主要在主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈，在脂質(zhì)代謝、膽固醇高敏感性等方面與人類相似。且具有體型小、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，為探索不同藥物作用的靶點(diǎn)提供了新思路。

2 豬模型

普通飲食喂養(yǎng)的豬也有發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的可能，通過改變喂養(yǎng)方式，豬還能自發(fā)地發(fā)展成動(dòng)脈粥樣硬化。豬具有與人類相似的脂蛋白譜，病變部位在冠狀動(dòng)脈，且體型夠大，可以對(duì)動(dòng)脈進(jìn)行無創(chuàng)測(cè)量，并采集足夠的血管組織進(jìn)行分析。此外，在闡明血流動(dòng)力學(xué)異質(zhì)性的相互作用以及動(dòng)脈內(nèi)皮層的反應(yīng)方面具有重要作用。Gerrity和Davies等人對(duì)豬的研究結(jié)果顯示，低脂飲食模式下的豬也顯示出主動(dòng)脈通透性增強(qiáng)或有限區(qū)域，不同動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化血栓易感和耐藥部位的內(nèi)皮基因的表型也有所不同。高膽固醇血癥主要累及LDL并產(chǎn)生主要泡沫細(xì)胞粥樣硬化病變。此外，富脂泡沫細(xì)胞與無脂單核細(xì)胞之比會(huì)隨時(shí)間發(fā)生變化，這說明病變是動(dòng)態(tài)的。由于豬的生長發(fā)育緩慢，喂養(yǎng)成本高，建模花費(fèi)時(shí)間長，故豬模型的應(yīng)用存在著一定的制約。

3 兔模型

兔子可能是對(duì)高膽固醇飲食最敏感的動(dòng)物，也是建立動(dòng)脈粥樣硬化模型最早的動(dòng)物。渡邊遺傳性高膽固醇血癥(WHHL)兔的LDLR存在缺陷，與膽固醇飲食模式下的新西蘭白兔相比，LDL為WHHL兔的主要脂蛋白。WHHL兔的病變主要來源于平滑肌細(xì)胞(SMC)衍生的泡沫細(xì)胞。WHHL雜合子兔在膽固醇飲食誘導(dǎo)下出現(xiàn)特征性病變，這與純合子家族性高膽固醇血癥患者高度接近。近年來也出現(xiàn)了ApoE轉(zhuǎn)基因兔子，兔子作為食草性動(dòng)物，其體內(nèi)的脂質(zhì)蛋白與人類有一定差異，在代謝方面也不盡相同，更重要的是，人類動(dòng)脈粥樣化主要發(fā)生在冠狀動(dòng)脈，而兔主要在小動(dòng)脈。總而言之，兔子在不同的喂養(yǎng)條件下，會(huì)產(chǎn)生不同的病變特點(diǎn)，而且容易發(fā)生感染導(dǎo)致死亡，這是該模型在應(yīng)用中急需解決的關(guān)鍵問題。

4 斑馬魚動(dòng)物模型

斑馬魚是在研究發(fā)育和人類疾病模型中可靠的動(dòng)物模型。斑馬魚具有體型小、喂食成本低、易于繁殖、體外受精、發(fā)育迅速等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)可行的大規(guī)模靶點(diǎn)篩選。斑馬魚與鼠、兔、豬等AS動(dòng)物模型相比，在高膽固醇飲食模式誘導(dǎo)下，最為顯著的變化是氧化脂蛋白急劇增加，這使其成為研究脂蛋白氧化機(jī)制的可靠模型。斑馬魚現(xiàn)已成為研究動(dòng)脈粥樣硬化的替代動(dòng)物模型，特別是在動(dòng)脈粥樣硬化的早期進(jìn)展方面。目前，主要有以下幾種斑馬魚模型，且應(yīng)用較為廣泛。

4.1 apoc2突變斑馬魚

利用TALEN技術(shù)敲除斑馬魚中的

apoc2

后，結(jié)果顯示

apoc2

突變斑馬魚發(fā)生了嚴(yán)重的乳糜酶血癥和高甘油三酯血癥，這與缺乏

APOC2

的人類有相近的表現(xiàn)。正常飲食模式誘導(dǎo)下的

Apoc2

幼蟲，脂質(zhì)積累增加，并出現(xiàn)含脂質(zhì)巨噬細(xì)胞，與人類Ⅱ型AS病變發(fā)展過程中觀察到的結(jié)果類似。因此，正常飲食模式誘導(dǎo)下的

apoc2

斑馬魚可作為篩選高脂血癥潛在藥物的模型。

4.2 lxr突變斑馬魚

膽固醇分解代謝中的肝臟X受體(LXRs)發(fā)揮著重要作用。

Lxr

突變斑馬魚在高膽固醇飲食模式或高脂肪飲食模式誘導(dǎo)下，LDL顯著增加，易引起嚴(yán)重的高膽固醇血癥和肝脂肪癥，與人類相似。故該模型可用于篩選潛在的腸道限制性LXR激動(dòng)劑。

4.3 cetp突變斑馬魚

膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CETP)是一種主要在肝臟和脂肪組織中合成的酶，可使HDL的分解速度加快，并在逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的過程中發(fā)揮重要作用。運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚的

cetp

基因后，可使高密度脂蛋白膽固醇含量增加，產(chǎn)生抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，但其自噬系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生，進(jìn)而加快動(dòng)脈粥樣硬化形成。該模型可用于CETP抑制劑的研究并進(jìn)一步探索CETP在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中的作用機(jī)制。

5 鳥類模型

目前主要有鴿子和鵪鶉作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀€(gè)別鳥類可自發(fā)形成動(dòng)脈粥樣硬化病變，而鵪鶉作為其中之一，不僅操作方便、喂養(yǎng)成本低等優(yōu)點(diǎn)，而且早期脂質(zhì)斑塊與人類高度相似。但由于物質(zhì)代謝與人類存在一定差異，故大多用于抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物作用的評(píng)價(jià)，并未作為治療模型應(yīng)用。持續(xù)高膽固醇的誘導(dǎo)是鵪鶉模型建立成功的關(guān)鍵。隨著喂養(yǎng)時(shí)間的增加，病變的嚴(yán)重程度也增加，其血漿、LDL-C、HDL-C水平均增加，而HDL-C的增加與該動(dòng)物模型的年齡有一定關(guān)系。白卡奴鴿(WC-As)是可自發(fā)出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化的鳥類。該模型建模時(shí)間短、成本低，操作簡便，但由于其體型小且動(dòng)脈較細(xì)，部分操作以及誘導(dǎo)損傷較難進(jìn)行。大部分實(shí)驗(yàn)用鳥類產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化是因?yàn)榛虮磉_(dá)缺失所致，這與人類涉及的復(fù)雜機(jī)制是不同的。

6 非人靈長類動(dòng)物模型

非人靈長類動(dòng)物中也有與動(dòng)脈粥樣硬化血栓和脂蛋白代謝相關(guān)的探索。常見長尾猴、長毛猴和松鼠猴，它們的動(dòng)脈粥樣硬化血栓易感性從低到高依次排列。恒河猴、食蟹猴和狒狒等也曾被研究，它們具有與人類脂蛋白代謝高度相似的非HDL脂蛋白、HDL亞類以及CETP的表達(dá)。此外，在高膽固醇飲食模式下，雄性動(dòng)物模型發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化血栓的可能性更高。恒河猴在高膽固醇飲食模式的誘導(dǎo)下會(huì)出現(xiàn)復(fù)雜的冠狀動(dòng)脈病變，表現(xiàn)為血管的密度增加，內(nèi)膜增厚。而在低膽固醇飲食模式的誘導(dǎo)下，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化血栓則可減退，恒河猴是最早發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象的物種之一。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，恒河猴在高脂肪飲食誘導(dǎo)下動(dòng)脈粥樣硬化血栓的發(fā)生率與食蟹猴不同。食蟹猴對(duì)飲食的表現(xiàn)更明顯，血漿膽固醇水平幾乎是恒河猴的兩倍，其病變發(fā)展速度更快、泡沫細(xì)胞更豐富。狒狒的脂蛋白和動(dòng)脈粥樣硬化血栓反應(yīng)還有一定的個(gè)體差異。雖然靈長類動(dòng)物在各器官結(jié)構(gòu)、冠狀動(dòng)脈病變部位等方面與人類是高度接近的，但由于建模所需費(fèi)用、血栓發(fā)展所需時(shí)間以及有限的遺傳信息等因素的影響，應(yīng)用非人靈長類動(dòng)物模型研究動(dòng)脈粥樣硬化血栓仍有一定的局限性。

7 展望

AS是一種復(fù)雜的進(jìn)行性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。目前臨床治療AS的藥物包括他汀類藥物、抗血栓藥物和手術(shù)干預(yù)以緩解并發(fā)癥，但目前仍沒有有效或特異性的AS治療藥物。因此，尋找新的藥物靶點(diǎn)和開發(fā)更安全、有效的抗血栓策略是當(dāng)前國際研究的熱點(diǎn)和亟待解決的科學(xué)問題。現(xiàn)有研究AS的動(dòng)物模型逐漸豐富，不同的研究靶向可以選擇不同的動(dòng)物模型，應(yīng)用不同的方法，從而取得一定的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。完善現(xiàn)有動(dòng)物模型的不足，探索新的動(dòng)物模型，建立可靠有效、與人類各器官結(jié)構(gòu)、細(xì)胞功能相近的動(dòng)物模型仍是我們不斷追求的目標(biāo)，以進(jìn)一步攻克心腦血管疾病領(lǐng)域的更多難題。