分離自野生獼猴桃的釀酒酵母A12-2和BL20對獼猴桃酒品質的影響

朱 靜，楊曉聰，陳亞藍，王閃閃

（信陽農林學院食品學院，河南信陽 464000）

獼猴桃營養豐富[1]，市場接受度高，有廣闊的市 場應用前景。目前，我國獼猴桃的種植面積位于世界第1位，年產量居世界第4位，主要分布在河南、陜西秦嶺區域等區域[2]，獼猴桃銷售方式以鮮銷為主，然而由于貯藏技術有限，導致大量次果鮮銷困難[3]，因此，加大果實加工產品的開發，對于獼猴桃資源的利用有很大的意義和前景[4]。目前針對獼猴桃的加工產品主要涉及果汁、果酒、果干、果脯、果醬、果糕等[2,5]，其中果酒具有加工利用率高，風味獨特，營養價值高[6]，市場前景廣闊的特點。釀造果酒的質量主要與釀造時選用的酵母品種有關，采用普通酵母釀造的獼猴桃果酒發酵性差[7-8]，因此，較多的研究集中在獼猴桃釀酒酵母品種的分離純化和選育[4,9]上，而關于獼猴桃釀酒酵母在釀造工藝及其工藝參數優化[9]和野生獼猴桃酵母菌種與商用酵母特性對比的研究較少。已報道分離純化的獼猴桃釀酒酵母主要有菌株1-21和1-31[9]、野生酵母JM11[10]、菌株Q3[11]以及菌株GT-1、GT-2等[12]，但上述酵母釀造的果酒還存在色澤較淺、VC和酒精產量低、發酵效果并不理想等問題。

本試驗以前期從大別山區野生獼猴桃中分離的專用酵母 A12-2和 BL20（以下簡稱 A12-2、BL20）為研究對象，與商用酵母：安琪果酒專用酵母RW、安琪酵母RV002（以下簡稱RW、RV002）對比，通過測定發酵過程中的總酸、酒精度、糖度、pH、VC、揮發性香氣成分，并進行感官評價，闡述A12-2和BL20的發酵特性及其對產品品質的影響，為野生獼猴桃專用酵母和獼猴桃果酒的開發提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

安琪果酒專用酵母RW、安琪酵母RV002 安琪酵母股份有限公司；野生獼猴桃釀酒酵母BL20和A12-2 信陽農林學院微生物實驗室保藏；野生獼猴桃 信陽商城大別山山脈采摘；白砂糖 購自當地西亞超市；偏重亞硫酸鉀（食品級） 河南禾興生物科技有限公司；檸檬酸（食品級） 廣東康達生物科技有限公司；葡萄糖、瓊脂粉、氫氧化鈉、抗壞血酸、碳酸氫鈉（分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；可溶性淀粉（分析純） 天津市巴斯夫化工有限公司；YEPD培養基 參照蔣成等[11]的方法配制。

HH-6電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；STARTER3C pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；ZHJH-C1112C智城超凈工作臺、ZWY-2112B恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；SPX-250生化培養箱 北京科偉永興儀器有限公司；HW遠紅外干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；TG16臺式高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；GC9800氣相色譜儀 上海科創色譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母擴大化培養流程 實驗室保藏的酵母菌菌種→菌種活化→菌種擴大培養→菌種的檢驗→菌液離心→濕菌體

1.2.2 菌種擴大化培養操作要點 菌種活化：按郝愛玲等[13]的方法，將-80 ℃甘油保藏的酵母菌涂布接種 100 μL于YEPD平板上，30 ℃ 恒溫培養 2～3 d。

菌種擴大培養：挑取活化的單菌落接種于5 mL YPD試管中，30 ℃ 165 r/min培養過夜，即種子液。以5%的接種量，將種子液接種于150 mL YPD三角瓶中，同條件下培養48 h。

酵母菌種的檢驗：用接種環挑取1環的菌液，制成水浸片，在顯微鏡下觀察，檢測菌體是否純凈。

菌液離心：在超凈工作臺中，將菌液倒入滅菌的離心管中，4000 r/min離心15 min，倒掉上清液，反復多次，至全部離心結束，將無菌水倒入帶有酵母菌沉淀的離心管，8000 r/min離心10 min，重復2～3次，棄去清液得濕菌體。

1.2.3 獼猴桃果酒發酵工藝 新鮮的獼猴桃清洗去皮，切碎打漿，加蔗糖調節糖度到20°Brix。將偏重亞硫酸鉀（60 mg/L）溶于經滅菌（75%酒精）過的含有10 mL水的廣口瓶中，加入打漿好的獼猴桃汁液，加果膠酶（100 mg/L），50℃水浴脫膠4 h，加入檸檬酸將pH調至3.50，按1 g/L接種1.2.2中的濕菌體，22 ℃前發酵6 d，雙層紗布過濾，18 ℃后發酵6 d，用500 mg/L皂土（50 ℃熱水活化后使用）澄清，換罐、去除沉淀，15 ℃陳釀后，雙層紗布過濾后采用0.45 μm濾膜過濾除菌，即獲得成品獼猴桃果酒[14-15]。

1.2.4 理化指標測定 總酸的測定采用國標GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中指示劑法測定；可溶性固形物的測定參考Wei等[16]進行；還原糖的測定采用斐林法[17]；VC的測定采用國標GB5009.86-2016《食品中抗壞血酸的測定》中2,6-二氯靛酚滴定法；pH的測定采用國標GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中pH計法；酒精度的測定采用國標GB5009.225-2016《酒中乙醇濃度測定》中酒精計法。

1.2.5 成品的揮發性香氣成分 采用氣相色譜法，參照朱靜[18]、琪安等[19]方法進行部分揮發性物質分析。

1.2.5.1 樣品處理 檢測時取2 mL待測樣放入5 mL頂空瓶中，每毫升樣品中加入20 μL內標（50 g/L 4-甲基-2-戊醇的丙酮溶液）終濃度為9.8 mmol/L，在60 ℃下保溫處理30 min，使氣液平衡，然后用500 μL微量進樣器在距液面0.3 mm處吸取300 μL頂空瓶上層氣體，注入氣相色譜儀（GC-17A/FID，SHIMADZU，日本）中，檢測揮發性化合物的殘留量。

1.2.5.2 色譜條件 色譜柱為彈性石英毛細管柱DB-WAX-10（φ0.53 mm×30 m），載氣 N2，進樣量300 μL；采取程序升溫，設初始溫度為 55 ℃，在 55 ℃下保持 3 min；然后 15 ℃/min 升至 200 ℃，在 200 ℃保持3 min。

1.2.5.3 揮發物化合物含量的計算方法 對照內標濃度和峰面積，計算對照樣品和處理樣品中揮發性化合物無濃度，按照式（1）計算高級醇降解量。

式中：9.8 為內標的終濃度（mmol/L），A樣為處理樣品中的揮發性化合物峰面積，A內為內標的峰面積。1.2.6 感官評價 由10位經驗豐富，具有專業知識的人員組成感官評定小組進行感官評定。獼猴桃酒的感官評定標準見表1，參照國標GB/T15038-2006葡萄糖、果酒通用分析方法和胡小琴等[19]的方法。

表1 獼猴桃酒感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standard for kiwi fruit wine

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母在發酵過程中對獼猴桃果酒總酸的影響

總酸（以酒石酸計）作為獼猴桃果酒發酵中的一個重要指標，對獼猴桃果酒口感及風味具有重要影響。由表2可知，四種酵母菌發酵獼猴桃果酒總酸含量整體先上升后逐漸趨于平緩。1～9 d四種酵母均呈現上升趨勢，主要原因是果酒帶渣發酵，原材料中存在的乳酸菌、酵母菌利用糖產生乳酸[20-21]，且發酵過程中酵母細胞通過EMP和HMP途徑將葡萄糖降解為丙酮酸、乳酸、檸檬酸等一些有機酸[22-24]，導致總酸含量增加。6 d時A12-2和BL20總酸含量高于兩種商用酵母，兩種野生獼猴桃釀酒酵母之間總酸含量差異較小，A12-2的總酸含量最高為17.23 g/L。9～12 d四種酵母總酸含量呈較平穩狀態，原因可能是發酵后期發酵液中的糖分幾乎耗盡，故酸度漸趨于平穩。發酵終止時的總酸含量為：RV002升至最高，為18.86 g/L；RW 次之，為18.47 g/L；A12-2 為18.17 g/L，BL20為18.16 g/L，總酸含量從高到低依次排序為RV002＞RW＞A12-2＞BL20。

表2 前發酵和后發酵總酸含量變化Table 2 Content of total acid during pre-fermentation and post-fermentation

2.2 釀酒酵母在發酵過程中對獼猴桃果酒可溶性固形物的影響

獼猴桃果酒中可溶性固形物可以反映酵母菌的生長繁殖情況及耗糖能力。由表3可知，添加A12-2、BL20和安琪RW、RV002的樣品在前發酵1～3 d的可溶性固形物含量急劇下降，而添加酵母A12-2的樣品比安琪酵母下降趨勢更大，之后降低趨勢明顯放緩至基本保持不變。主要是酵母菌生長繁殖需要大量的糖類，其會分解糖類，導致可溶性糖類含量急劇下降，后期因為無氧環境以及營養物質消耗殆盡，酵母菌大量死亡，分解糖的能力降低[25]。

表3 前發酵和后發酵可溶性固形物含量變化Table 3 Content of soluble solid state material during pre-fermentation and post-fermentation

從下降趨勢來看，酵母A12-2樣品的可溶性固形物含量下降速率最快，3 d時A12-2可溶性固形物含量降至最低為7.16°Brix，說明酵母A12-2分解糖的能力較其他酵母更好，更適宜作為發酵菌種使用。后發酵階段，BL20和RW釀造的獼猴桃果酒可溶性固形物含量均降至8.5°Brix，A12-2和RV002可溶性固形物含量降至8.0°Brix，發酵終止時可溶性固形物含量從低到高依次排序為A12-2=RV002＜BL20=RW。研究顯示，酵母菌降糖的速度與酵母菌利用糖轉化為酒精的速度即酵母菌發酵能力密切相關[26]。綜上可知，A12-2和RV002的發酵能力較強，BL20和RW次之。

2.3 釀酒酵母在發酵過程中對獼猴桃果酒還原糖的影響

還原糖的含量也是衡量果酒發酵進程的一個重要參數，由表4可知，四種釀酒酵母釀造的獼猴桃果酒中還原糖在1～7 d時均呈下降趨勢，7～12 d，隨著發酵時間的延長，四種酵母釀酒中還原糖的下降趨勢明顯放緩。可能的原因是前期酵母發酵消耗了大量還原糖，后期酵母數量減少，因此對還原糖的利用降低。發酵中止時，四種酵母釀酒中還原糖的含量分別為：BL20為 6.35 g/L，A12-2為 6.43 g/L，RV002為6.91 g/L，RW為6.61 g/L，從高到低排序為：RV002＞RW＞AI2-2＞BL20。

表4 前發酵和后發酵還原糖含量變化Table 4 Content of reducing sugar during pre-fermentation and post-fermentation

2.4 釀酒酵母在發酵過程中對獼猴桃果酒VC的影響

由表5可知，在1～12 d時，四種酵母菌釀造的獼猴桃果酒中VC含量均呈下降趨勢，可能原因是發酵時溫度升高以及有氧和無氧呼吸導致酒樣中的VC被氧化分解，A12-2和BL20釀造果酒VC含量無明顯差異，下降幅度較為平緩，且整體高于兩種商用酵母的VC含量，兩種商用酵母下降幅度較大、VC含量較低。12 d時，四種酒樣VC含量均降至最低：BL20為95.40 g/L，A12-2為 87.90 g/L，RV002為85.20 g/L，RW最低，為77.40 g/L。四種酵母釀酒中VC含量從高到低依次排序為BL20＞A12-2＞RV002＞RW，其中BL20釀造的獼猴桃果酒中VC含量最高，RW釀造的獼猴桃果酒中VC含量最低，酵母BL20較適合釀造獼猴桃果酒。

表5 前發酵和后發酵VC含量變化Table 5 Content of VC during pre-fermentation and post-fermentation

2.5 釀酒酵母在發酵過程中對獼猴桃果酒pH的影響

有機酸含量與果酒的感官品質密切相關，對果酒的口味、風味、香氣等有重要影響。果酒中的有機酸包括乳酸、乙酸、醋酸、檸檬酸、蘋果酸以及其他酸類物質，有機酸的含量可通過pH反映。

由表6可知，四種酵母釀造的獼猴桃果酒的pH在前發酵過程整體無較大幅度變化，商用酵母相比于野生獼猴桃釀酒酵母波動較小。2 d時兩種野生獼猴桃果酒pH呈下降趨勢，速度較快；3 d時BL20 pH降至 3.44；4 d時 A12-2 pH降至 3.42，3～8 d時，pH下降的原因一是酵母菌發酵主要產生酒精，二是帶渣發酵中其他微生物代謝產生乙酸、乳酸、醋酸和少量二氧化碳等有機酸，三是葡萄糖酵解的一系列中間產物也呈酸性[21]。由表6可知，在8 d至后發酵結束，pH呈上升趨勢且變化較為平緩、差異較小，是因為隨著發酵時間的推移，生成的有機酸和乙醇被利用發生酯化反應，生成酯類物質，使有機酸含量下降[27]。12 d時，BL20的pH最大，為3.72，從高到低依次排序為 BL20＞A12-2＞RW＞RV002。

表6 前發酵和后發酵pH變化Table 6 Content of pH during pre-fermentation and post-fermentation

2.6 釀酒酵母在發酵過程中對獼猴桃果酒酒精度的影響

果酒發酵過程復雜，發酵期間原料果漿中的糖被酵解為酒精[28]，支撐起果酒的香氣和風味，使果酒風味醇厚，具有結構感。

由表7可知，各菌種達到最高酒精度的時間大概是第9～12 d，在3～8 d酒精度會大幅度提升，因為酵母菌大量繁殖后開始進行無氧呼吸，糖被分解成酒精、二氧化碳和其他產物[29]。4種酵母菌的最終（12 d）酒精度從高到底依次為 A12-2＞BL20＞安琪 RW＞安琪 RV002（A12-2為 13.80%vol，BL20為13.70%vol、安琪 RW為13.00%vol、安琪 RV002為12.00%vol），但酵母菌 A12-2 在 1～10 d，酒精生成量總體高于BL2，在2～4 d期間 BL20上升最快，6 d時A12-2上升幅度最大為12.6%vol，說明酵母A12-2產酒精迅速，產酒能力較好。作為一株優良的釀酒菌種，能在短時間內達到一定產酒量是一項重要的性能，所以從產酒力來說達到某個所需酒精度（一般果酒酒精度在9%vol～12%vol）的時間越短越好。

表7 前發酵和后發酵酒精度含量變化Table 7 Content of alcohol in pre-fermentation and post-fermentation

由表7可知，8～12 d酒精含量趨于平緩，主要原因是發酵后期酒精含量高抑制酵母菌發酵，且后發酵階段發生的酯化反應中酒精被消耗，故發酵趨于平緩[23]。

2.7 揮發性香氣成分分析結果

獼猴桃酒中的香氣物質包括：酯類、醇類、萜烯類、酸類及醛酮類等[30]，高級醇是酵母通過Ehrlich途徑將氨基酸或糖代謝生成[31]，苯乙醇、異戊醇和己醇的含量范圍為140.92～536.57 μg/mL，己醇具有水果香味，丁酸乙酯和己酸乙酯散發出水果味和甜味[32]。課題組主要研究正己醇等高級醇及其酯類的轉化，測定以下主要揮發性物質，為后期酒的品質改良奠定基礎。四種酒的氣相色譜圖見圖1。

圖1 發酵獼猴桃果酒狀態圖Fig.1 State diagram of fermentation kiwi fruit wine

由表8可知，四種酵母菌株釀造的獼猴桃果酒揮發性香氣成分均有己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、己醇等。四種酵母菌釀制的獼猴桃果酒所測五種揮發性物質含量分別為25.13、34.21、14.62和23.33 mg/L，從高到低依次排序為BL20＞A12-2＞RV002＞ RW。四種不同酵母的揮發性香氣成分含量存在一定的差異，BL20釀造的獼猴桃果酒中這五種揮發性香氣物質含量最高，RW釀造的獼猴桃果酒中揮發性香氣物質含量最低。而BL20含量最高的香氣成分為丁酸乙酯，且為獼猴桃果酒典型性香氣成分。根據周元等[33]的研究，己酸乙酯具有水果甜香味，丁酸乙酯具有梨、花香，乙酸丁酯有強烈的水果香氣、具先辣后甜似菠蘿味道，乳酸乙酯具有優雅的氣味，正己醇具有水果芳香，進一步說明BL20釀造的獼猴桃果酒香味最為濃郁。綜上所述，BL20釀造的獼猴桃果酒風味最佳。

表8 釀酒酵母釀造的獼猴桃果酒部分香氣成分Table 8 Part aroma components of kiwi fruit wine brewed by two kinds of Saccharomyces cerevisiae

2.8 釀酒酵母對獼猴桃果酒感官評分的影響對比

由表9及圖1可知，BL20釀造的獼猴桃果酒感官評分最高為86分，其酒樣澄清透明，色澤透亮，香味最濃郁，酒體較醇厚具有典型性，品質最佳。

表9 獼猴桃酒感官評價Table 9 Sensory evaluation of kiwi fruit wine

3 討論與結論

本文以野生獼猴桃果酒的總酸、糖度、VC、pH、酒精度、揮發性香氣物質含量為指標，通過對比前期實驗室保藏的野生獼猴桃釀酒酵母A12-2、BL20和普通商用酵母：安琪果酒專用酵母RW、安琪酵母RV002釀造獼猴桃果酒的品質差異，說明野生獼猴桃釀酒酵母的發酵特性及對獼猴桃果酒品質的影響。本文四種酵母釀造的獼猴桃果酒總酸含量均＞18 g/L，酵母RV002較馬佳佳等[22]采用徐香獼猴桃釀造果酒的總酸值高（10.3 g/L），可能是采用的獼猴桃原料不同、菌種不同等因素造成；本文四種酵母可溶性固形物至12 d時含量＞8.0°Brix，還原糖含量＜7 g/L。與周元等[33]研究相比，分解糖的能力較弱、耗糖速率略慢，后者在第9 d時可溶性固形物可降低到6～7°Brix，其起始可溶性固形物含量為 18°Brix，本文調節初始可溶性固形物含量為20°Brix。與黎星辰等[25]研究相比，分解糖的能力相當；本文釀酒酵母BL20釀造的獼猴桃果酒VC含量為95.4 g/L，與馬榮山等[34]研究結果相比VC含量較低；本文四種酵母所釀獼猴桃酒的pH約3.6，與李影等[23]的研究相比偏低；采用A12-2和BL20釀造的獼猴桃酒的酒精度分別為13.8%vol和13.7%vol，與黎星辰等[35]的研究相比酒較高，但均在0%vol～14%vol范圍內，說明前期篩選的A12-2和BL20產酒精能力較好；BL20釀酒酵母釀造的獼猴桃酒正己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯和正己醇含量分別為1.80、28.5、0.25、2.00和1.66 mg/L；BL20釀造的獼猴桃果酒感官評分最高為86分，品質最佳。