miR-221/222與乳腺癌ERα表達及他莫昔芬敏感性的關系

侯蕾 馬源婧 霍欣欣 史學麗

小分子RNA（microRNA，miRNA）是近年來發現的一類不編碼蛋白質的內源性短鏈RNA［1］。有研究表示，其可以通過種子序列與靶基因mRNA 3′端非編碼區域（3′UTR）的核苷酸互補配對，直接降解沉默靶mRNA，從而在轉錄后水平調控基因表達［2］。miR-221/222 是內皮細胞高表達的微小RNA，均定位于人X 染色體中，兩者的轉錄本和種子序列相同，有高度的同源性［3］。目前，miR-221/222 已被證實與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡和侵襲轉移等病理過程密切相關，并可作為腫瘤治療的生物標記物［4］。在乳腺癌中，miR-221/222 在侵襲性較低的雌激素受體-α（estrogenreceptor-α，ERα）陽性乳腺癌細胞中呈低表達，miR-221 可以直接作用于ERα3′UTR區，與ERα 的表達相關。而ERα 是目前乳腺癌內分泌治療的金標準，他莫昔芬（Tomaxifen，TAM）則是目前臨床中內分泌治療的一線用藥，其也作為ERα的阻斷劑被廣泛應用于臨床。有研究表示［5］，microRNA 可以通過藥物特定的方法影響乳腺癌細胞的化療過程中耐藥性，一些內源性的microRNA 與TAM 的耐藥及細胞的生長、凋亡相關；而miR-221/222 的靶基因與抑癌基因p27Kip1，凋亡因子c-kit、Bmf 相關，其可通過調控抑癌基因及凋亡因子參與腫瘤的發生和發展。本研究擬探究miR-221/222 與乳腺癌ERα 表達與他莫昔芬敏感性關系。

1 資料與方法

1.1 病例和標本

分析2019年1月至2021年12月石家莊市婦幼保健院104 例經乳腺癌切除術的患者資料。納入標準：①患者均為女性；②首次接受乳腺癌切除術治療的患者；③臨床相關資料完成的患者。排除標準：有遠處轉移的乳腺癌患者。其中患者均為單側乳腺浸潤性癌，平均年齡（49.33±8.65）歲，按美國癌癥聯合會《AJCC 癌癥分期手冊》［6］進行TNM 分期，其中Ⅰ期28 例、Ⅱ期64 例、Ⅲ期12例。癌組織標本取自癌灶中央組織，癌旁組織取自距癌組織邊緣≥1 cm 的組織。

1.2 免疫組織分析

所有組織標本均經甲醛固定、70%無水乙醇梯度脫水、石蠟包埋并切割成4 μm 的切片，對組織免疫組化染色，嚴格按照SP試劑盒的操作標準完成操作。

閱片時隨機選擇10 個視野觀察細胞的表達情況，由兩名資深閱片師，采用雙盲法獨立閱片（已知陽性片）。采用強度和數量積分相乘的方法對組織表達情況進行評價，其中強度評定標準［7］如下：陰性（-）計0分，淺棕色為弱陽性（+）計1 分，棕色為中度陽性（++）計2 分，深棕色為強陽性（+++）計3 分；其中和+為低表達，++和+++為高表達。量化評定標準［8］如下：陰性計為0 分，＜25%計為1 分，5%（含）～50%計為2 分，50%（含）～75%計為3分，≥75%計為4 分。

1.3 RNA 提取

根據RNA 提取試劑盒的操作標準對組織的總RNA 進行提取。將組織標本收集至EP 管中，加入1 mLTrizol 試劑，并使用組織研磨器進行研磨裂解處理；將組織與試劑充分混合后加入200 μL 氯仿，震蕩30 s 后靜置5～10 min。在1 200 rpm（離心半徑為10 cm）離心后，取上清液，在加入500 μL 異丙醇沉淀離心，棄上清液，加入75%乙醇充分漂洗震蕩后，離心棄上清液；將RNA 充分干燥后，加入20 μL DEPC 水溶解。采用分光光度計測定RNA 濃度。

1.4 細增殖抑制率和細胞凋亡率

將ERα 陽性人乳腺癌細胞株MCF-7 用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）及鏈霉素（100 μg/mL）的DMEM 培養基，于37℃、25%體積分數的CO2培養箱中孵育。取對數生長期的ERα 陽性人乳腺癌細胞，將其分為空白對照組、miR-221 抑制組、miR-222 抑制組、miR-221/222 抑制組，分別進行轉染；在轉染后，給予2MLTAM 5 μg/mL。

在轉染后24、48 h 時取，采用MTT 法對各組吸光度（OD490）值進行測定，將孔板染色，每孔加20 μL MTT（5 mg/mL）工作液，常規培養4 h 后，吸去MTT 后在每孔中加入150 μL DMSO 慢搖混勻，使用酶標儀檢測各孔OD 值，重復測定3 次后取平均值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=（1-處理組A/空白對照組A）×100%。

在轉染后24、48 h 時取生長狀態良好的細胞。接種培養24 h 后，棄培養液后加入PBS 洗滌兩次，0.25%胰酶消化細胞后加完全培養基，離心棄上清，PBS 重懸計數，離心后棄去上清；在加入Binding Buffer 懸浮細胞，依次加入V-FTTC5μL、PI 10 μL 染色液。在室溫下避光孵育5 min 以上后，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 統計學方法

本研究采用統計學軟件SPSS 24.0 對數據進行處理，計量資料采用（）表示，行t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析進行檢驗，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-221/222 在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達水平比較

miR-221/222 在乳腺癌中的表達水平為（4.32±0.88）、（3.46±0.85）明顯高于相應癌旁乳腺組織（2.32±0.76）、（2.15±0.59），差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 miR-221/222 在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達水平比較Figure 1 Comparison of the expression levels of Mir-221/222 in breast cancer tissues and adjacent tissues

2.2 miR-221/222 與乳腺癌病理組織表達的相關性

miR- 221/222 的表達水平在ER-α 表達陰性、PR 表達陰性組均顯著高于陽性表達組，差異有統計學意義（P＜0.05）。miR-221/222 的表達水平在Her-2 表達陽性顯著高于陰性組，差異有統計學意義（P＜0.05）。在三陰性分子亞型中的表達顯著高于Her-2 過表達型、luminal A 及luminal B1 型乳腺癌，差異有統計學意義（P＜0.05）；miR-221/222 的表達水平與患者的年齡、TNM 分期無關（P＞0.05）。見表1。

表1 乳腺癌組織中miR-221/222 表達水平與臨床病理指標的相關性（±s）Table 1 Expression level of Mir-221/222 in breast cancer tissues and clinicopathological indicators Correlation（±s）

表1 乳腺癌組織中miR-221/222 表達水平與臨床病理指標的相關性（±s）Table 1 Expression level of Mir-221/222 in breast cancer tissues and clinicopathological indicators Correlation（±s）

n年齡F/t 值0.856 P 值0.394 F/t 值1.922 P 值0.057 TNM 分期2.586 0.080 1.939 0.149 ERα 表達4.936＜0.001 7.039＜0.001 PR 表達3.723＜0.001 5.357＜0.001 Her-2 表達3.414＜0.001 9.827＜0.001分子分型病理指標≥50＜50Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期陰性陽性陰性陽性陰性陽性luminal A luminal B Her-2 過表達型三陰型38 66 16 58 30 32 72 44 60 58 44 13 44 30 17 miR-221 相對表達水平4.16±0.65 4.28±0.71 4.11±0.76 4.25±1.03 4.69±0.98 4.88±1.05 3.92±0.85 4.70±1.06 4.01±0.83 4.16±1.25 4.96±1.06 3.52±0.81 3.99±0.76 4.51±0.97 4.98±0.72 10.243＜0.001 miR-222 相對表達水平4.45±0.58 4.20±0.67 3.52±0.85 3.84±0.72 4.05±1.12 4.51±1.23 3.13±0.75 4.26±0.97 3.34±0.78 3.31±0.75 4.88±0.86 3.20±0.63 3.67±0.54 4.35±0.65 4.76±0.74 23.127＜0.001

2.3 各組細胞的增殖抑制率比較

在轉染24、48 h 的各組的細胞增殖抑制率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較顯示，miR-221 抑制組與對照組轉染后24、48 h細胞增殖抑制率比較，差異均無統計學意義（P＜0.05）；miR-222 抑制組與miR-221 抑制組轉染后24、48 h 細胞增殖抑制率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；miR-221/222 抑制組轉染后24、48 h細胞增殖抑制率均明顯高于其余三組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞的增殖抑制率比較（±s）Table 2 Comparison of proliferation inhibition rates among all groups（±s）

表2 各組細胞的增殖抑制率比較（±s）Table 2 Comparison of proliferation inhibition rates among all groups（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與miR-221 抑制組比較，bP＜0.05；與miR-222 抑制組比較，cP＜0.05。

組別空白對照組miR-221 抑制組miR-222 抑制組miR-221/222 抑制組F 值P 值6 6 6 6轉染24 h 后3.62±0.79 3.81±0.84 3.75±0.80 6.88±1.03abc 19.736＜0.001轉染48 h 后22.86±2.33 23.06±2.95 24.82±3.50 45.07±7.13abc 36.091＜0.001

2.4 各組細胞凋亡率比較

轉染后24、48 h 各組的細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，miR-221 抑制組與對照組轉染后24、48 h 細胞凋亡率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；miR-222 抑制組與miR-221 抑制組轉染后24、48 h 細胞凋亡率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；miR-221/222 抑制組轉染后24、48 h 細胞凋亡率高于其余三組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組細胞凋亡率比較（±s）Table 3 Comparison of apoptosis rates in each group（±s）

表3 各組細胞凋亡率比較（±s）Table 3 Comparison of apoptosis rates in each group（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與miR-221 抑制組比較，bP＜0.05；與miR-222 抑制組比較，cP＜0.05。

組別空白對照組miR-221 抑制組miR-222 抑制組miR-221/222 抑制組F 值P 值n6 6 6 6轉染24 h 后5.84±1.96 6.02±2.05 6.28±1.88 8.86±1.67abc 3.36 0.039轉染48 h 后46.65±7.62 48.36±8.32 47.86±8.47 74.33±6.90abc 17.46＜0.001

3 討論

乳腺癌是世界范圍內女性發病率最高的一種惡性腫瘤，其發生于乳腺上皮組織，嚴重威脅著女性的生命健康安全。乳腺癌作為雌激素依賴性的腫瘤，與雌激素水平密切相關，ERα 及PR 均為特殊功能蛋白，對乳腺癌的生長發展有一定的調節作用［9］，測定ERα 和PR 的表達情況對于乳腺癌的進展、治療等具有一定的意義。近年研究表示，miRNA 可以通過調控腫瘤細胞發生、轉移和侵襲等相關基因的表達，從而影響腫瘤生長、轉移的過程；且miRNA 在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達存在一定差異，因此提示miRNA 與乳腺癌的發生個發展有著密切的關聯［10］。

本研究結果表示，miR-221/222 在乳腺癌組織中的表達水平均明顯高于相應癌旁乳腺組織。miRNA 可以下調凋亡程序性細胞死亡因子4 和Fas配體表達，抑制凋亡通路誘導的細胞死亡，從而導致乳腺癌細胞過度增殖，致使腫瘤發生；同時還可以通過調控細胞微環境來影響腫瘤細胞轉移，同時，其能上調血管內皮生長因子A（VEGF-A）表達［11］，從而促進腫瘤組織內血管生成，加快腫瘤細胞生長和發展。外源性高表達的miR-221/222 可使影響細胞增殖分化的FOXO3 蛋白和使可以抑制G1/S 轉換的P27 的表達下降，從而使MCF-7 細胞G1/S 期轉變及細胞增殖。miRNA 表達作為乳腺癌發生的重要影響因素，miRNA 的表達異常與乳腺癌的病理學特征也有一定的關系。在本研究中miR-221/222 的表達水平在ERα 表達陰性、PR 表達陰性組均顯著高于陽性表達組，miR-221/222 的表達水平在Her-2 表達陽性顯著高于陰性組；在三陰型分子的表達顯著高于Her-2 過表達型、luminal A 及luminal B1 型乳腺癌。ER 包含ERα 和ERβ 兩個亞型，乳腺癌細胞ERα 和ERβ 的表達水平均會對癌細胞的增殖能力產生一定的影響，ERβ 可抑制乳腺癌細胞增殖，ERα 則可促進乳腺癌細胞的增殖［12］。miR-221/222的表達水平在ERα 表達陰性組明顯高于陽性組，也提示miR-221/222 參與ERα 表達，對ER-α 表達有著負調節作用，影響著調節乳腺癌的發生和發展。且miR-221/222 可通過下調細胞因子信號轉導抑制因子1 和周期蛋白依賴性激酶抑制因子1B，從而加快癌細胞進入S 期，并通過靶向磷酸酶和張力蛋白同源物/蛋白激酶B 通路使乳腺癌干細胞進行自我更新，影響乳腺癌細胞的生長和侵襲能力，因此miR-221/222 在三陰型乳腺癌中表達較高。

乳腺癌作為雌激素依賴性腫瘤，乳腺癌的發生與ERα 密切相關［13］，且乳腺癌中miR-221/222過表達可降低ER-α 的表達，且下調miR-221/222可以部分恢復ER-α 的表達和對他莫昔芬的敏感性。本研究中，miR-221/222 抑制組轉染后24、48 h細胞增殖抑制率、細胞凋亡率均明顯高于空白對照組、miR-221 抑制組、miR-222 抑制組；共抑制miR-221/222 可明顯降低細胞的增殖率和凋亡率，與方煜彤等研究結果一致［14］。也提示，抑制miR-221/222 可增加ER-α 陽性細胞對TAM 的敏感性，抑制miR-221/222 的表達可能會是影響臨床對于內分泌耐藥治療靶點。

綜上所述，miR-221/222 水平與腺癌患者的ERα 表達相關，其可通過調節ERα 的表達水平影響乳腺癌的生長、遷移和侵襲，同時可影響乳腺癌細胞對TAM 的敏感性，miR-221/222 有望成為乳腺癌預后判斷的潛在標志物及治療靶點，但還需要大量樣本及數據進行進一步研究和證實。