雷公藤治療系統性紅斑狼瘡的網絡藥理學分析*

楊鋒磊，紀 偉

(1.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029；2.江蘇省中醫院風濕科，江蘇 南京 210029)

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種好發于育齡期女性，以多臟器受損為主要臨床特征的慢性自身免疫性疾病，主要累及心、肺、腎、腦等多個系統。SLE在中國大陸地區的患病率為30/10萬～70/10萬[1]，男女比例約為1∶9。目前SLE發病機制不明，存在較多爭議，多認為是免疫、遺傳、感染、性激素等因素綜合作用導致。SLE治療多采用糖皮質激素聯合免疫抑制劑，同時，長期使用此治療方案帶來的一些不良反應，如骨髓抑制、肝腎損傷和骨質疏松等不容忽視。

中藥雷公藤具有清熱化瘀、利水消腫、祛風除濕、止痛等功效。雷公藤常被運用于治療風濕免疫疾病，被用于SLE的治療且療效確切。既往基礎研究及臨床研究表明，雷公藤有效成分及其制劑等可以改善狼瘡小鼠癥狀及相關指標，在治療SLE過程中，與激素或免疫抑制劑聯用優于單用激素或免疫抑制劑[2-5]。雷公藤治療SLE雖有一定的臨床療效，但對其作用機制研究卻并不全面，本研究力求通過網絡藥理學，深入挖掘雷公藤有效成分治療SLE潛在作用機制，為雷公藤治療SLE提供理論依據。

1 資料與方法

1.1雷公藤有效成分、靶點基因的篩選 在TCMSP平臺[6]以口服生物利用度(OB值)≥30%、藥物相似性(DL值)≥0.18為篩選條件，初步篩得雷公藤有效活性成分及相應靶標，將藥物靶點在Uniprot數據庫[7]中處理成標準化基因名。

1.2SLE疾病靶點信息的篩選 以“systemic lupus erythematosus”為關鍵詞在Genecards[7]、OMIM[7]、TTD[8]、Drugbank[9]數據庫中檢索，去重后，獲取SLE疾病相關靶點。

1.3雷公藤對SLE作用靶點預測 將收集到的雷公藤成分靶點和SLE靶點導入Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)相互映射，得到兩者共同靶點，即雷公藤治療SLE潛在作用靶點。采用Cytoscape軟件(V3.9.0)繪制“雷公藤-活性成分-潛在作用靶點-SLE”圖。

1.4蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡的構建 雷公藤對SLE的治療效應是多個蛋白交互作用的結果。使用STRING網絡數據庫[10]分析雷公藤治療SLE的作用靶點，形成PPI，篩選置信度0.400以上的蛋白互作關系數據，將其導入Cytoscape軟件(V3.9.0)重新繪制可視化作用靶點的PPI網絡。

1.5GO和KEGG富集分析 為分析雷公藤治療SLE的潛在作用機制，了解其靶點在基因功能和信號通路中的作用，將雷公藤治療SLE靶點導入DAVID數據庫[11]，展開GO、KEGG富集分析。限定物種為“Homo sapiens”，標識符設置為“official gene symbol”，設定P<0.05，用微生信作圖工具(http://www.bioinformatics.com.cn/login/)將富集結果中與疾病相關基因功能及信號通路進行可視化展示。

2 結 果

2.1雷公藤成分靶點和SLE疾病靶點篩選 在TCMSP數據庫共獲得雷公藤51種潛在藥效成分、493個相關靶點，剔除23個沒有對應靶點的成分和343個重復靶點，得到28個藥物有效成分和150個對應靶點。根據收集到的數據構建“雷公藤-活性成分-靶點”網絡圖，見圖1。圖中結點(node)表示雷公藤、活性成分、潛在靶點，邊(edge)表示三者之間的關系。其中多個成分可以共同作用于一個靶點，度值(dgree)>30的成分分別為山柰酚(63)、β-谷甾醇(39)、雷公藤甲素(35)、川陳皮素(35)、豆甾醇(31)。在Genecards、OMIM、TTD、Drugbank數據庫中搜索“systemic lupus erythematosus”，去重后得到與SLE相關的靶點共1 447個。

2.2雷公藤-SLE治療靶點預測 利用VENNY2.1.0將150個雷公藤靶點與1 447個SLE相關靶點取交集，雷公藤-SLE共同靶點共有82個，即雷公藤治療SLE作用靶點，見圖2。將藥物、活性成分、關鍵作用靶點和疾病關系導入Cytoscape軟件(V3.9.0)中構建“雷公藤-活性成分-潛在作用靶點-SLE”圖，見圖3。從圖中可以看出，在雷公藤28個活性成分中，與82個潛在作用靶點相連接的共27個，治療SLE主要依靠5種活性成分：山柰酚(40)、雷公藤甲素(30)、川陳皮素(22)、β-谷甾醇(21)、豆甾醇(12)。

2.3PPI構建及關鍵靶點篩選 將82個共同靶基因導入STRING在線數據庫中，初步構建PPI網絡圖，去除游離靶點，該圖共涉及81個靶基因、1 054條基因互作關系線，見圖4。將在STRING數據庫中得到的TSV文件導入Cytoscape軟件(V3.9.0)中，重新繪制PPI圖，見圖4。顏色越深、結點越大對應的degree值越大；邊越粗、顏色越深反映combined score值越大。將degree值大小進行降序排序，篩選排名前30的靶基因，繪制核心基因圖，見圖4。TNF、AKT1、JUN、VEGFA、TP53、CXCL8、PTGS2、MMP9前8個基因排名較前，這些degree值較大的基因可能在雷公藤治療SLE的網絡中發揮重要作用。繪制前8位核心基因與雷公藤主要活性成分對應關系，發現除PTGS2外其余7個基因均與主要有效成分相連，此7個基因為核心基因。見圖4。

2.4GO功能富集分析 雷公藤治療SLE的GO功能富集分析見圖5，結果顯示，雷公藤治療SLE主要涉及細胞因子介導的信號通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、炎性反應、對藥物的反應等生物學過程；涉及質膜、細胞外區、大分子復合物等細胞組成；涉及相同的蛋白質結合、蛋白質同二聚化活性、酶結合、類固醇結合等分子功能。

2.5KEGG通路富集分析 雷公藤治療SLE的KEGG通路富集分析結果見圖6，結果顯示，雷公藤治療SLE的效應機制主要與皮質類固醇和心臟保護、通過 Nrf2 誘導基因表達的氧化應激、Th1/Th2 分化、非分型流感嗜血桿菌激活NF-κB、Toll樣受體通路、人類巨細胞病毒和圖激酶途徑、T細胞極化過程中趨化因子受體的選擇性表達等信號通路有關。

3 討 論

本研究基于網絡藥理學分析方法，篩選獲得雷公藤有效成分28種，主要通過82個潛在作用靶標治療SLE，根據雷公藤-成分-疾病-靶點網絡圖結果顯示，山柰酚、雷公藤甲素、川陳皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等為雷公藤治療SLE的關鍵成分。山柰酚屬于黃酮類化合物，具有抗癌、抗炎、抗氧化應激等生理功能[12]。研究表明，山柰酚通過降低促炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-8)的表達和AGS細胞中IL-8的產生，起到抗炎作用[13]。NLRP3炎癥小體在SLE疾病發展過程中的作用已被證實[14]，即抗原抗體免疫復合物通過上調Toll樣受體依賴的NF-κB途徑及刺激活性氧的產生，激活NLRP3炎癥小體，使IL-1β等分泌增加，加重SLE患者病情。山柰酚可以促進細胞自噬，滅活NLRP3炎癥小體，仍需要更多研究證實山柰酚對SLE的治療作用。雷公藤甲素在治療SLE時具有減輕腎損傷、改善皮膚及黏膜損傷、減輕血管炎性反應等作用。SLE患者外周血Tc與Th細胞比例在疾病發展不同階段存在差異，疾病活動期Tc/Th失衡，Th1/Th2、Tc1/Tc2值增加[15-16]。雷公藤甲素[17]通過抑制Tc1/Tc2、Th1/Th2值，調節細胞因子分泌，使不同階段Tc、Th比值相對穩定，從而減輕自身免疫組織損傷，控制SLE疾病進展。川陳皮素具有抗氧化、減少MMPs和炎癥表達的特性，通過激活SIRT-1/FOXO3a介導的自噬和線粒體功能來改善肝缺血和再灌注損傷[18]。LIN等[19]發現，川陳皮素抑制人滑膜細胞中IL-1誘導的PGE2的產生及干擾脂多糖誘導的PGE2的產生。β-谷甾醇、豆甾醇屬于植物甾醇[20]，通過減少促炎性細胞因子及趨化因子的釋放，抑制STAT1信號通路，發揮抗炎作用。

根據構建的雷公藤-SLE蛋白互作網絡及條形圖，TNF、AKT1、JUN、VEGFA、TP53為排列前5的靶蛋白。TNF[21]是一種主要的炎性細胞因子，能夠促進機體抗原與T淋巴細胞產生免疫應答，被發現在SLE患者血清中升高，并與SLE疾病活動度呈正相關。AKT1[22]在PI3K/AKT信號通路處于下游位置，在外周B細胞分化和T細胞穩態中發揮作用，參與血管生成、蛋白合成等生物學過程，其通過激活PI3K/AKT/mTOR通路，激活IL-17、IL-4等細胞因子，抑制Treg細胞而參與SLE發病過程。另有研究發現，SLE患者B細胞中AKT上調表達，AKT激活mTOR促進B細胞增生[23]。JUN[24]通過參與SLE患者分泌產生AP-1依賴的促炎性細胞因子及FCGR2B啟動子激活的轉錄調控過程，影響SLE疾病的進程。VEGFA[25]，通常被稱為VEGF，是內皮細胞功能障礙、毛細血管通透性增加和血管生成的關鍵調節因子，連續血管生成、免疫介導的血管內皮細胞損傷和功能障礙在SLE中起著重要的病理作用[26]，有研究表明，雷公藤在對BALB/c裸鼠誘發性紅斑狼瘡模型的治療中，可阻斷VEGFA與VEGFR1結合，抑制血管炎性反應，減少組織血管新生及皮損[27]。

靶點GO功能富集分析顯示，雷公藤治療SLE主要涉及細胞因子介導的信號通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、炎性反應、對藥物的反應等生物學過程；涉及質膜、細胞外區、大分子復合物等細胞組成；涉及相同的蛋白質結合、蛋白質同二聚化活性、酶結合、類固醇結合等分子功能。

靶點KEGG通路富集分析結果顯示，雷公藤治療SLE的效應機制主要與皮質類固醇和心臟保護、通過 Nrf2 誘導基因表達的氧化應激、Th1/Th2 分化、非分型流感嗜血桿菌激活NF-κB、Toll樣受體通路、人類巨細胞病毒和圖激酶途徑、T細胞極化過程中趨化因子受體的選擇性表達等信號通路有關。雷公藤可增強腎上腺皮質功能[28]，其乙酸乙酯提取物興奮下丘腦-垂體-腎上腺軸，促進皮質激素分泌。有研究證實，雷公藤多苷聯合激素治療SLE在降低患者疾病活動度方面優于常規激素療法，可能與雷公藤多苷促進GR表達，自身糖皮質激素結合GR增多，自身免疫應答得到抑制有關。能否使用雷公藤促進SLE患者減少激素用量仍需要更多臨床研究證實[29-30]。通過 Nrf2 誘導基因表達的氧化應激通路是抗氧化防御的重要信號通路，有研究顯示，SLE患者的血液、組織和免疫細胞中的氧化應激水平升高，氧化應激水平與疾病活動度相關，證明Nrf2具有治療SLE的靶標潛力[31-33]。巨細胞病毒(CMV)屬于皰疹病毒家族[34-35]，在有初始癥狀或疾病惡化的SLE患者中觀察到CMV DNA和高血清IgM抗CMV水平，CMV感染被認為可能是SLE發病重要的病因。

本研究基于網絡藥理學闡述雷公藤活性成分及相關靶點，分析雷公藤治療SLE的相關靶點及通路，初步預測其主要成分山柰酚、雷公藤甲素和川陳皮素等通過TNF、AKT1、JUN、VEGFA、TP53等核心靶點，以及皮質類固醇和心臟保護、通過 Nrf2 誘導基因表達的氧化應激、Th1/Th2 分化等信號通路治療SLE。雷公藤治療SLE作用機制具有多成分、多靶點、多通路的特性，為臨床及實驗研究雷公藤治療SLE作用機制、有效撤減激素提供理論依據。