基因多態性與妊娠期高血壓疾病的相關性研究

馬新利，武海英，張婷婷，王秋明，張 暋△

(1.鄭州金域臨床檢驗中心有限公司實驗診斷部，河南 鄭州 450000；2.河南省人民醫院產科，河南 鄭州 450003)

妊娠期高血壓疾病是孕婦妊娠期特有的一種疾病，包括妊娠期高血壓、子癇前期-子癇，妊娠合并慢性高血壓和慢性高血壓伴發子癇前期，發病率占妊娠期并發癥的2%～8%，是導致全世界范圍內產婦和胎兒死亡的首要病因之一[1]。妊娠期高血壓疾病的病因和發病機制復雜，迄今為止發病機制依然不明確，但是隨著人類基因組學和分子生物學技術的不斷發展，對妊娠期高血壓疾病的病因研究關注點開始集中于遺傳因素上。大量研究發現，CORIN基因[2]、NR3C2基因[3]、AGTR1基因[4]、AGT基因[5]、NOS3基因[6]、STOX1基因[7]、ERAP2基因[8]、MMP-9基因[9]、TNF-α基因[10]、IL-10基因[10]、GAS6基因[11]、MTHFR基因[12]和EPHX1基因[13]的多態性與妊娠期高血壓疾病發生發展有關，本研究選取以上13個基因的熱點研究位點，應用基質輔助激光解吸離子飛行時間質譜技術探討基因多態性與妊娠期高血壓疾病易感性的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6—12月在河南省人民醫院住院的46例妊娠期高血壓疾病孕產婦為研究組，同時選取同期住院的50例健康孕產婦為對照組。妊娠期高血壓疾病參考《婦產科學》第9版的診斷標準[14]：妊娠20周后出現收縮壓≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和(或)舒張壓≥90 mm Hg，產后12周內血壓恢復正常。排除患有肝、腎疾病，心臟病，糖尿病等其他嚴重并發癥者。

1.2儀器與試劑 外周血基因組DNA提取采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(51106)試劑盒，聚合酶鏈反應(PCR)采用Agena Complete iPLEX?Pro Genotyping Reagent Set，基因分型使用Agena MassARRAY?Analyzer 4儀器。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提取 抽取患者外周血2 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，顛倒混勻后吸取200 μL，按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(51106)試劑盒說明書提取基因組DNA，用Nanodrop檢測待檢基因組DNA，確保DNA濃度在10 ng/μL以上，260 nm和280 nm處吸光度比值(A260/A280)在1.6～2.0，置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2基因分型 選取文獻報道可能與妊娠期高血壓疾病相關的Corin(rs387906895、rs387906894)、NR3C2(rs41511344)、AGTR1(rs5186)、AGT(rs4762、rs699、rs388972)、NOS3(rs1799983、rs2070744)、STOX1(rs1341667、rs10509305)、ERAP2(rs2549782)、TNF-α(rs1800629、rs1799724)、IL-10(rs1800896)、GAS3(rs1803628)、MTHFR(rs1801133)、EPHX1(rs1051740)基因多態性位點，利用美國Agena公司的AgenaCx軟件設計PCR引物和單堿基延伸引物。提取好的DNA經PCR擴增，SAP純化，單堿基延伸反應，樹脂脫鹽純化后將樣品點樣到芯片上，采用Agena MassARRAY?Analyzer 4對提取的樣本進行多態性檢測，應用Typer Analyzer軟件進行數據分析和基因分型。

2 結 果

2.1妊娠期高血壓疾病危險因素的單因素分析結果 2組在收縮壓和舒張壓2個指標上比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。根據妊娠期高血壓疾病血壓標準(收縮壓≥140 mm Hg，舒張壓≥90 mm Hg)，實驗分組符合預期。2組在年齡、體重、妊娠時間和文化程度方面比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。研究組妊娠期高血壓病史人數顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 妊娠期高血壓疾病危險因素的單因素分析

2.22組基因型和等位基因頻率比較 統計研究組和對照組18個單核苷酸多態性(SNP)位點基因型結果見表2。15個SNP位點(rs3889728、rs1799983、rs4762、rs1051740、rs10509305、rs2070744、rs1803628、rs1799724、rs1341667、rs1801133、rs2549782、rs5186、rs699、rs1800629、rs1800896)具有基因多態性，3個SNP位點(rs387906895、rs41511344和rs387906894)沒有基因多態性。

根據基因型計算結果顯示，研究組和對照組間rs1799983、rs1051740和rs2070744位點基因型比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，其他位點基因型差異無統計學意義(P>0.05)。等位基因計算結果顯示，rs1051740和rs2070744等位基因差異有統計學意義(P<0.05)，其他位點基因型差異無統計學意義(P>0.05)。位點rs1051740和rs2070744的等位基因C在妊娠期高血壓疾病人群中發病風險度(95%可信區間)[OR(95%CI)]分別為1.82(0.99～3.34)和2.24(0.90～5.57)。見表2。

表2 研究組和對照組 SNP 位點基因型和等位基因分布結果

3 討 論

目前，越來越多的證據表明，妊娠期高血壓疾病的發生和發展與遺傳相關[15-16]。本研究分析了文獻報道與妊娠期高血壓疾病相關的18個SNP位點，15個位點的基因型和等位基因在研究組和對照組間差異均無統計學意義(P>0.05)，rs3889728 位點基因型差異有統計學意義(P<0.05)，但是等位基因差異無統計學意義(P>0.05)，說明這16個SNP位點可能與妊娠期高血壓疾病無關，初步推測可能與種族、地理環境和樣本量不足有關。

rs2070744是NOS3基因中的一個SNP，NOS3主要分布于冠狀血管和心腔面的內膜，可以催化生成一氧化氮。一氧化氮為內皮舒張因子，具有調節血管舒張、抑制血管平滑肌增殖等功能。本研究中rs2070744位點組間基因型和等位基因差異有統計學意義(P<0.05)，C等位基因在妊娠期高血壓疾病人群中發病風險較高，可能是妊娠期高血壓疾病發病的高危因子。推測可能的機制為rs2070744是啟動子區域中的一個SNP,NOS3基因rs2070744位點基因多態性影響mRNA的表達水平，使酶合成降低，從而導致一氧化氮的合成降低，進而導致內皮功能障礙誘發妊娠期高血壓疾病。本研究與文獻[17-18]研究結果相符合，驗證了本研究結果的有效性，在一定程度上提高了本研究成果的可信度。

rs1051740是EPHX1基因中的一個SNP，環氧化物水解酶是一種重要代謝酶，其參與外源性化學物質體內生物轉化第二時相的反應，編碼該酶的基因存在一定程度的變異，使其在代謝過程中的作用發生相應改變。本研究rs1051740位點組間基因型和等位基因差異有統計學意義(P<0.05)，C等位基因在妊娠期高血壓疾病人群中發病風險較高，可能是妊娠期高血壓疾病發病的高危因子。推測可能的機制為rs1051740是EPHX1基因第3號外顯子中的一個SNP，rs1051740位點發生T>C轉換，導致EPHX1第113密碼子由TAC轉換為CAC，其編碼的氨基酸殘基由酪氨酸轉變為組氨酸，從而影響蛋白質的穩定性而降低酶的活性，使脂類代謝異常，進而導致內皮細胞受損引起妊娠期高血壓疾病。

綜上所述，NOS3和 EPHX1 的基因多態性與妊娠期高血壓疾病有一定的關聯，是該病發病率高的潛在遺傳易感基因。本研究發現，年齡、體重、妊娠時間和文化程度不是妊娠期高血壓疾病的危險因素，妊娠期高血壓病史是妊娠期高血壓疾病的獨立危險因素。故推測妊娠期高血壓病史可能與NOS3和 EPHX1 的基因多態性有關。但是，本研究樣本數量有限，還需擴大樣本量進一步研究。其次，NOS3基因的SNP位點 rs2070744和EPHX1基因的SNP位點rs1051740多態性導致蛋白表型的差異，不同突變形式的蛋白究竟通過何種機制或信號通路影響妊娠期高血壓遺傳易感性，值得深入研究。本研究從基因多態性方面為妊娠期高血壓疾病的早期臨床篩選提供候選基因，為妊娠期高血壓疾病的早期診斷、治療提供了分子生物學依據。