組學技術在茶葉研究中的應用進展

顏廷宇，余奇東，林全女，程福建，朱建新，楊江帆

1. 福建農林大學園藝學院（福州 350000）；2. 茶學福建省高校重點實驗室（福州 350000）

茶葉是中國南方最重要的經濟作物之一，其內含物質豐富，化學成分是由93.0%～96.5%的有機物和3.5%～7.0%的無機物組成，是一種天然的保健產品，具有抗氧化[1]、抗腫瘤[2]、降脂[3]、降糖[4-5]、降壓[6]、抗動脈粥樣硬化[7]、抗病毒[8-9]、抑菌[9-11]等多種保健和藥理作用，可用于開發(fā)保健食品、抗心血管病和抗腫瘤藥品、抗齲牙膏、天然食用色素、食品抗氧化劑以及環(huán)境凈化劑等，具有廣泛的應用前景。

組學技術能夠獲得一個生命體、組織或器官、單細胞的全部遺傳信息、轉錄信息、蛋白及代謝產物，主要包括基因組學、蛋白組學、代謝組學、轉錄組學、脂類組學等。隨著組學技術快速在茶葉領域發(fā)展，多組學研究時代已經成為當今茶葉領域的又一主流和熱門研究。蘇小琴等[12]通過組學技術對茶葉的栽培育種、種質資源特性、生理生化、加工及貯藏方向進行講述，認為多組學分析將會成為今后茶葉品質機理探索的強大科研工具。虞昕磊等[13]講述代謝組學分析茶葉品質形成的應用，通過講述代謝組學技術在茶葉品質形成及調控、基因功能注釋、栽培選育、揭示代謝網絡調控機理等方面應用，認為代謝組學在茶葉領域取得了重大突破。程曉梅等[14]通過對蛋白組學在茶葉抗逆性、突變體等研究方面進行綜述，認為植物蛋白組學發(fā)展迅速并取得了優(yōu)質成果，對于茶葉蛋白組學的研究發(fā)展相對較慢。但隨著新技術和理論的出現，茶葉蛋白組學研究會更加廣泛和深入。前人多是從茶葉相關問題角度以及研究方向出發(fā)，講述組學在茶葉領域的應用研究，然而對于從組學相關技術角度對茶葉研究講述得較少，相關領域期刊重點均是在茶葉各領域，如栽培育種、抗逆脅迫、種質資源特性等。文章從各組學技術對茶葉科學領域研究進展進行討論。

1 轉錄組學技術在茶葉研究中的應用進展

轉錄組學是從RNA水平研究基因表達的情況，從整體水平上研究細胞中基因轉錄的情況及轉錄調控規(guī)律的學科[15]。轉錄組受外部環(huán)境和內部因素共同控制，形成在不同發(fā)展階段差異的基因表達情況[16-17]。轉錄組研究方法有高通量測序（high-throughput sequencing）、基因表達序列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、互補DNA擴增片段長度多態(tài)性技術（cDNA-AFLP）、表達序列標簽（expressed sequence tag，EST）等。目前，轉錄組學技術在茶葉研究中非常普遍，轉錄組學在茶葉抗性機理、品種資源以及次級代謝產物生物合成調控機制等方面得到了應用，并取得了重要成果[18]。

1.1 高通量測序技術

高通量測序技術是一次對幾十萬到幾百萬的DNA分子進行序列測定[19]。在茶葉科學領域，高通量測序技術多用于分析茶葉mRNAs和microRNAs的表達譜[20-21]，從而探究茶葉種質資源特性[22]、土壤菌落[23]、遺傳多樣性[24]、抗逆脅迫等[25-26]。隨著高通量測序技術的迅速成熟，轉錄組學研究進入了一個新時代。研究者將高通量測序技術應用于研究轉錄本在組織和細胞中的種類和表達，轉錄組測序這一術語也逐漸被廣泛使用[27]。陳林波等[28]通過高通量測序篩選調控“紫娟”花青素合成相關miRNA，通過差異表達分析，篩選出可能參與調控花青素合成的4個miRNA，包括miR828a、miR845c、novel14和novel87，其預測的靶基因包括轉錄因子基因MYB4、MYB23、MYB26、MYB82、bHLH74以及4-香豆酰輔酶A鏈接酶等基因。該研究結果為進一步開展茶樹花青素生物合成的調控機制研究奠定基礎，同時證明高通量技術非常適合用于茶葉中有效成分的篩選。

1.2 基因表達序列分析

基因表達序列分析可以利用9個核苷酸長度的序列標簽代表特定的mRNA轉錄物，并對所有表達基因水平進行定性和定量分析，對檢測低豐度表達的基因高度敏感[29]。它適用于發(fā)現生物體中尚未被測序到基因組中的新基因，也可為識別難以檢測的開放閱讀框和新基因提供證據。因此，這項技術的應用將有助于茶葉功能基因[30]、抗逆脅迫[31]、種質資源特性[32]等研究。近年來發(fā)展的方法可以同時分析兩個或多個試驗樣本之間表達差異的所有基因[33-34]。陳暄等[35]通過3’/5’RACE獲得低溫誘導后特異表達的差異片段cDNA全長序列。所得序列全長981 bp，其開放閱讀框編碼275個氨基酸。該基因與白菜、煙草、擬南芥中的CBF基因編碼的氨基酸序列分別有74%，57%和57%的同源性。用RT-PCR方法分析低溫處理過程中CBF基因的表達情況，結果表明，CBF在低溫誘導4 h開始表達，8 h左右達到高峰，隨后下降，但仍維持較高水平。結果表明，CBF可能在茶樹抗寒分子機制的形成過程中發(fā)揮重要的作用。

1.3 cDNA-AFLP

cDNA-AFLP是一種結合mRNA和AFLP差異顯示技術的分子標記，具有獨特的優(yōu)點，如假陽性低、重復性好、多態(tài)性高、多功能性好、不需要基因組信息、對基因差異表達和轉錄信息反應準確等優(yōu)點[36]。cDNA-AFLP是一種被用于植物轉錄階段受生物脅迫所導致的基因表達。Gupta等[37]通過使用cDNA-AFLP方法鑒定茶葉因干旱脅迫而特異表達基因。聚類分析揭示了兩種類型的聚類：Ⅰ型將耐性和易感品種分開，而Ⅱ型則將樣品的時間點分開，這可以分為早期和晚期響應。

1.4 表達序列標簽

表達序列標簽是對組織或細胞基因組進行大規(guī)模cDNA克隆和測序獲得的表達序列標簽。EST表示某一特定時間在組織或細胞中表達的基因。表達序列標簽數量的迅速增加已成為分子標記開發(fā)的重要資源[38]。在茶葉科學研究中一般采用cDNA文庫和EST測序技術對茶葉分子生物學進行探索，包括EST-SSR/STR標記開發(fā)應用，抗性脅迫基因和次生代謝基因克隆與表達等，加快對茶葉生長代謝的探索和認識，并取得了一些重要進展，對研究抗逆性的分子機制具有積極意義。Taniguch等[39]通過構建7個來自不同器官的cDNA文庫，并利用文庫生成ESTs，獲得17 458條EST序列，組裝成5 262條非基因序列。利用100對EST-SSR引物對茶葉進行了擴增和多態(tài)性分析。71對引物成功擴增出EST-SSR，70個EST-SSR位點表現出多態(tài)性。EST加強茶樹等茶屬植物重要性狀和分子遺傳學的研究。

2 蛋白組學技術在茶葉研究中的應用進展

蛋白質組學是生物研究中發(fā)展最快的領域之一，通過蛋白組學的研究，能快速分離鑒定與控制植物重要農藝性狀的蛋白質，運用逆向遺傳學方法鑒定基因功能，再利用基因工程手段將優(yōu)良的農藝性狀基因轉化農作物，以進一步提高作物產量、品質和抗逆性[40]。

2.1 雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2DE）

2DE是最經典、最成熟的蛋白質組分離技術[41-42]，根據蛋白質的等電點和分子量，對凝膠進行等電點聚集和電泳，以純化和區(qū)分復雜的蛋白質組成。Chien等[43]通過2-DE和Nano-LC/MS/MS結合IGAE和SVM-FS的雙層特征選擇機制去識別烏龍茶原產地標記的特征蛋白。準確率高達為95.5%。該方法可為進一步研究茶葉蛋白質組學奠定技術基礎，也為其他經濟作物中蛋白質的分離鑒定提供科學依據。

2.2 雙向熒光差異電泳（two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE）

雙向熒光差異電泳是基于雙向凝膠電泳和多重熒光分析的方法，特點是：每個蛋白質點都有自己的內部標記，每個蛋白質點的自動校準很好地消除了樣本中的假陽性。雙向熒光差異電泳技術統(tǒng)計可靠性在95%以上。李勤等[44]運用雙向電泳等方法研究葉綠體蛋白表達差異研究階段白化過程，探討茶葉白化的分子機制，將差異表達蛋白質凝膠酶水解，經酶法水解肽提取、真空濃縮、質譜檢測等處理鑒定，樣品綠體在前期、白化期和復綠期共鑒定其中差異表達蛋白59個，質譜鑒定蛋白22個。試驗最終表明白化現象與生理功能相關。

3 代謝組學技術在茶葉研究中的應用進展

代謝組學在基因組學和蛋白質組學的基礎上，對某一生物體內在特定時期所產生的低分子量物質進行定性定量分析[45-46]。根據對象不同，代謝組學可分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學[47]，反映生物體系受外界脅迫或基因變異的代謝產物變化情況，從而揭示其生命活動規(guī)律與調節(jié)機制。目前，代謝組學在茶葉研究中的應用集中于研究農藥殘留、加工工藝、環(huán)境脅迫以及地域差異等[48-49]。代謝組學中使用的分析工具包括核磁共振技術（NMR）、液相色譜-質譜（LC-MS）與氣相色譜-質譜（GC-MS）等[50]。

3.1 核磁共振技術

核磁共振技術作為結構分析的手段，已被廣泛應用于化學、結構生物學等多個領域，NMR技術能夠在不破壞樣本的基礎上實現快速準確分析，但是不夠靈敏[51]。如果樣品為固體或半固體，測試前將樣品攪碎，加入緩沖液中提取，若樣品為液體，則樣品不需要復雜的預處理。提取后可檢出含氘代水的磷酸鹽緩沖液[52-53]。由于對樣品破壞性小，適用于復雜體系，是代謝組學研究過程中比較常見的方法[54]。在NMR共振研究中，最常用的有核磁共振氫譜（1H-NMR）、核磁共振碳譜（13C-NMR）、核磁共振氮譜（15N-NMR）、核磁共振磷譜（31P-NMR）。Mozumder等[55]的多元統(tǒng)計分析與1H-NMR分析表明，不同茶樹齡的鮮茶葉代謝差異明顯。茶氨酸、谷氨酰胺、兒茶素、沒食子兒茶素等多種茶葉代謝產物隨茶樹年齡的變化而變化，茶氨酸代謝在嫩茶樹和老茶樹之間存在差異。

3.2 液相色譜-質譜

液相色譜-質譜具有準確度高、分離范圍廣、速度快的特點，可運用到生物學[56]、中藥學[57]、化學[58]、臨床醫(yī)學[59]等學科之中。Zhou等[60]為了研究大葉黃茶在加工過程中的化學變化，采用高效液相色譜和LC-MS對各工序的樣品進行了定量分析和定性分析。基于LC-MS的非靶向和靶向代謝組學分析表明，烘焙后的茶葉樣品與烘焙前相比有明顯的差異，表兒茶素和游離氨基酸的含量顯著降低，而兒茶素的含量顯著增加。Ge等[61]采用5-（diisopropylamino）amylamine（DIAAA）derivatization-UHPLC-Q-TOF/MS法對普洱茶中酚酸進行了定性定量研究，揭示了發(fā)酵對普洱茶酚酸的影響及其潛在效應。試驗測定了33種酚酸，其中大部分為首次在普洱茶中檢出。熟普和生普的主要成分分別為沒食子酸和茶皂素。試驗表明在普洱茶發(fā)酵過程中，大部分酚酸酯含量下降。液相色譜-質譜在茶葉生化成分的定性定量、指紋圖譜以及農藥殘留等方面的研究中得到廣泛應用。

3.3 氣相色譜-質譜

氣相色譜-質譜具有分析范圍廣、準確性高、速度快、對化學物的破壞性小、不需復雜操作和復雜經驗、適合對有機物質和生物性物質的優(yōu)點[62]。現階段從茶葉原葉以及成品茶中已分離鑒定的茶葉芳香物質有700余種，包括醛、醇、酮、酯、酸和含氮類等10余大類化合物。氣相色譜-質譜常用于產地鑒別、指紋圖譜、農藥殘留以及品質鑒定等方面[63]。Wang等[64]通過SBSE/GC-MS對龍井茶中的揮發(fā)性物質進行了提取和分析。分析鑒定出來151種揮發(fā)性化合物，醇、烷烴、醛和酯四大類化學物質占揮發(fā)性化合物總量的54%。香葉醇是龍井茶中含量最豐富的揮發(fā)性化合物，其次是己醛和β-紫羅蘭酮。通過氣相色譜-嗅覺儀分析、氣味活性值計算和香氣重組初步試驗，鑒定出龍井茶的主要香氣成分，包括2-甲基丁醛等14種揮發(fā)性化合物。龍立梅等[65]采用頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜對信陽毛尖茶41份樣品進行研究，建立了7個不同等級茶葉香氣成分的GC-MS指紋圖譜。根據所選取的23種特征香氣成分，通過判別分析，將樣品分為4組和3組。采用6種不同程度反映茶葉品級差異的指紋相似度計算方法，改進后的指紋相似度計算方法是其中最好的。

4 脂質組學技術在茶葉研究中的應用進展

脂質組學已成為組學領域的一門新興科學[66-67]。脂類是生物重要的生物分子，在茶葉細胞功能中細胞凋亡、信號傳導、物質運輸和能量儲存等方面發(fā)揮著重要作用[68-69]。隨著對脂質組學研究的不斷拓展與深入，脂質組學分析技術越來越多元化，主要包括NMR、LC-MS、GC-MS、薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）[70]、毛細管電泳-質譜聯用（capillary electrophoresis-mass spectrometer，CE-MS）[71]、電噴霧電離質譜（capillary electrophoresis-mass spectrometer，ESI-MS）[72]、“鳥槍法”（shotgun lipidomics）[73]、基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜（Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）[74-76]等。脂質組學要比其他組學起步較晚，最早的脂質組學論文出現在2003年[77]。脂質組學在應用方面廣闊，分析方法越來越呈體系[78]。但與其他組學相比，脂質組學研究不深入，導致研究領域對脂質組學的了解很少。但脂質組學在植物上面的研究卻是有著巨大的潛力，脂質組學的發(fā)展將促進生物學、醫(yī)學和生命科學相關領域的發(fā)展。因此，在植物學以及茶學領域中開展脂質組學的研究將為茶學發(fā)展提供一個嶄新的視角。

5 結語

如今組學研究已經成為茶學的主流研究方向，其中轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學為基礎的組學技術，在茶葉學科領域多方面開展研究。組學已成為茶葉研究的強有力工具。茶葉特有次生代謝基因現在成為基因發(fā)現的活躍領域。組學技術應用雖然可以應用在茶葉生長發(fā)育、特色種質資源、抗逆脅迫等相關研究，但是中國領土跨越大、氣候差異明顯、品種資源繁多、茶葉種類各異等，因此今后通過組學研究解決以上所帶來的茶葉品質差異和基因表達帶有巨大的突破，而近些年茶葉研究結合轉錄組學、代謝組學和蛋白組學連用等分析茶葉基因調節(jié)、特色種質資源、抗逆脅迫，并取得了許多成果。多組學的整合使代謝組之間能夠相互驗證，可以深入分析茶葉基因表達與各種生物系統(tǒng)的代謝機制之間的關系。總而言之，茶葉多組學研究分析必將成為解決茶葉科學現存問題的強有力工具與研究方向，對進一步解決茶葉栽培育種、抗逆脅迫、產地鑒別等發(fā)揮重要作用。組學技術發(fā)展極大地推動了茶葉研究進程。