丹參酮ⅡA調控子宮炎性微環境改善著床障礙大鼠著床窗期子宮內膜容受性的研究

崔靜靜，劉芳，張燕，曹平，馬燕*

(1.河北省故城縣醫院，衡水 253800；2.河北省井陘縣醫院，石家莊 050399；3.河北省黃驊市婦幼保健計劃生育服務中心，滄州 061200)

胚胎植入功能障礙已成為妊娠成功的瓶頸因素[1]。有數據表明，導致妊娠失敗的主要原因是胚胎著床障礙，在人類中其發生率高達78%[2]。子宮內膜容受性是指母體子宮內膜在特定時間接受胚胎著床的能力，這個時期被稱為“著床窗口期”[3]。成功的胚胎植入的先決條件是胚胎發育必須與子宮內膜容受性之間同步化[4]。因此，通過促進子宮內膜容受性的建立來改善胚胎著床是治療不孕癥的臨床突破之一。有動物實驗表明，子宮內膜可以接受囊胚著床的時間段是有限的，在嚙齒動物中只能持續幾個小時[5]。人體著床窗口主要在月經周期的第20天和第21天之間，這與子宮內膜上皮細胞表面的胞飲突出現時間較一致[6]；且胞飲突的數量與胚胎著床效力呈正相關，因此，胞飲突被認為是子宮內膜容受性的超微結構標志物[7]。

人類胚胎著床涉及與囊胚侵入蛻膜相關的炎癥反應的發生。胚胎需要突破子宮內膜上皮著床，建立母體子宮-胎盤血液循環。妊娠的結果取決于母體子宮微環境調節炎癥過程和建立母體耐受性的能力[8]。人們普遍認為，在懷孕早期，為了成功著床需要一個受調節的促炎微環境，允許母胎界面處的組織重塑和血管生成，然后轉變為允許胎兒生長和發育的免疫耐受性狀態[9]。盡管對生殖過程的理解有所進步，但著床失敗的機制在不孕癥和流產中仍不清楚。丹參酮是從丹參中提取的活性物質制劑，其中，丹參酮ⅡA是其主要的病理活性成分，可抑制樹突狀細胞介導的適應性免疫來減弱免疫系統疾病的發展，激活Nrf2/ARE信號通路和抑制核因子-κB(NF-κB)信號通路，具有抗氧化、抗炎、改善微循環等多種生物活性[10-11]。目前已有大量臨床證據表明丹參酮可以安全有效地治療包括與炎癥相關的多種疾病[12-13]。本研究中，我們進一步評估丹參酮ⅡA對著床障礙模型大鼠子宮炎癥微環境和子宮內膜容受性的影響，并對其作用機制進行初步探討。

材料和方法

一、實驗動物

實驗選用SFP級SD未孕雌性和雄性大鼠(6～7周齡)共40只，雌雄比為3∶1，體質量(250±20)g，由河北伊維沃生物科技有限公司提供，許可證號：SYXK(冀)2019-008。動物實驗于河北省實驗動物中心開展。大鼠在實驗前適應性飼養1周(早7∶00～19∶00光照，19∶00～次日早7∶00黑暗)，飼養溫度23℃左右，相對濕度55%，通風良好，自由飲水，給予標準飼料；飼養過程中依照3R原則給予所有動物人道主義關懷。本研究所涉及的實驗經河北醫科大學醫學倫理委員會批準(NO IACUC-Hebmu-2019027)。

二、主要試劑

丹參酮ⅡA-磺酸鈉購自上海純優生物(生產批號：568-72-9-10MG)；米非司酮片購自湖北葛店人福藥業(國藥準字H20033551)，于研缽中研碎后溶于丙二醇中配制成質量濃度為0.68 g/ml的米非司酮懸混液。

三、研究方法

1.動物分組、造模與處理：造模方法參考以往文獻報道[14]。適應性喂養期間，觀察所有雌鼠動情周期，剔除動情周期差異大的大鼠，并在第2個動情周期于每日17∶00進行交配，以雌雄比例3∶1合籠，次日9∶00發現陰栓者記為妊娠第1天。將20只妊娠雌鼠按照隨機數字表隨機分為正常對照組、模型組、丹參酮ⅡA低劑量組(10 mg·kg-1·d-1)、丹參酮ⅡA高劑量組(20 mg·kg-1·d-1)，每組5只。妊娠第1天，丹參酮ⅡA低劑量組、丹參酮ⅡA高劑量組大鼠分別灌胃相應劑量的丹參酮ⅡA，連續灌胃7 d；正常對照組和模型組在相同時間同法給予等體積生理鹽水。除正常對照組外，其余各組按5 mg/kg劑量在大鼠妊娠第4天9∶00行頸背部皮下注射米非司酮，以構建胚胎著床障礙模型，孕鼠數和平均著床胚泡數均顯著減少表示造模成功；正常對照組在相同時間注射等體積生理鹽水。

各組大鼠均于妊娠第8天9∶00使用頸椎脫臼法處死，迅速剖腹，觀察子宮形態，子宮血流供應狀況。將子宮內膜植入位點組織剪切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，分別保存于4%多聚甲醛溶液中(行HE染色及免疫組化)或避光保存于2.5%戊二醛中(行掃描電鏡觀察)。

2.掃描電鏡觀察子宮內膜胞飲突數量：將戊二醛溶液固定后的標本，用磷酸鹽緩沖液清洗，系列乙醇助劑脫水，放入體積分數為2%的乙酸異戊酯中3 h，臨界點干燥，樣本粘貼，涂銀膠，鍍金，經掃描電鏡(S-3500N，日立公司，日本)觀察胞飲突數量及形態。

3. 蛋白質免疫印跡(Western blot)實驗：將大鼠子宮內膜植入位點組織浸泡在RIPA緩沖液(R0010，北京索萊寶)(蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)中進行細胞裂解，然后在4℃下13 000 r/min離心30 min。收集上清，用BCA試劑盒(P0010S，碧云天)測定蛋白濃度。在PVDF膜(FFP28，碧云天)轉移之前，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(DYZ-22A型，北京六一儀器廠)處理蛋白。用兔抗大鼠白血病抑制因子(LIF)(1∶1 000，ab113262)，血管緊張素2(Ang-2)(1∶500，ab8452)，Toll樣受體4(TLR4)(1∶1 000，ab13867)，髓樣分化因子88 (MyD88)(1∶500，ab131071)、NF-κB p65磷酸化蛋白(p-p65)(1∶2 000，ab86299)多克隆抗體和兔抗大鼠血管內皮生長因子(VEGF)(1∶1 000，ab1316)單克隆抗體一抗孵育過夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，在室溫下與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(1∶2 000，ab6721)孵育30 min。所有一抗和二抗均購于美國Abcam公司。PBS沖洗PVDF膜4次，每次5 min，增強化學發光法(ECL)發光試劑盒發光顯影。然后應用化學發光成像分析系統(ImageQuant LAS 4000，GE Healthcare，美國)進行圖像采集，檢測LIF、Ang-2、VEGF、TLR4、MyD88和p-p65蛋白的相對表達水平。

4. 免疫組化染色：將子宮內膜植入位點組織樣本固定后制作石蠟切片，脫蠟脫水后，3% H2O2封閉和2%牛血清白蛋白分別用于去除內源性過氧化物酶活性和避免非特異性蛋白質結合位點。然后將組織切片與抗轉化生長因子-β1(TGF-β1)(1∶200，ab189778)或p65(1∶100，ab194726)的兔多克隆一抗在4℃下孵育過夜。洗滌切片，并在室溫下與山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000，ab205718)和山羊抗大鼠IgG(1∶2 000，ab97057)在4℃下孵育過夜。最后，組織切片用蘇木精復染、脫水、封片、晾干，并在光學顯微鏡下觀察。分析圖像，并通過光密度/陽性面積評估TGF-β1及p65表達水平。結果判定：以棕黃色顆粒為免疫組化陽性產物，采用Image-Pro 6.0圖像分析軟件測定陽性表達面積。

5. 酶聯免疫吸附測定(ELISA)：取子宮內膜植入位點組織樣本稱重，4℃下研磨成5%組織勻漿，冰上靜置后3 500 r/min離心15 min，吸取上清液，ELISA法檢測炎癥相關因子脂氧素A4(LXA4)(F01000，上海西唐生物科技有限公司)、白介素(IL)-1α(ab113350，abcam，美國)、IL-1β(ab100768，abcam，美國)、IL-6(ab100713，abcam，美國)、IL-4(ab100771，abcam，美國)的水平。嚴格按照ELISA試劑盒的說明書操作，分別設置空白孔和樣品孔。在450 nm處測量各孔的光密度(OD)，根據標準曲線定量測定LXA4、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-4的濃度。

四、統計學分析

結 果

一、丹參酮ⅡA對子宮內膜胞飲突表達的影響

為了研究丹參酮ⅡA對著床障礙模型大鼠著床窗期子宮內膜容受性的影響，我們首先在掃描電鏡下觀察胞飲突在子宮內膜的表達。結果顯示，正常對照組子宮內膜表面分布有許多膜狀突起，即發育中的胞飲突，其大小和形狀相似，膜狀突起之間的邊界清晰；模型組中子宮內膜表面偶見較少數量的胞飲突，胞飲突發育受到抑制或降解，膜狀突起邊界不清晰；丹參酮ⅡA低劑量組僅有少量發育中或發育完全的胞飲突，部分胞飲突表面形態規則，邊界清晰，發育較對照組延后；丹參酮ⅡA高劑量組中呈現較多發育中或發育完全且形態規則、邊界清晰的胞飲突，發育相比對照組略延后(圖1)。

正常對照組的子宮內膜表面分布有許多膜狀突起，即發育中的胞飲突；模型組子宮內膜表面偶見較少數量的胞飲突；丹參酮ⅡA低劑量組僅有少量發育中或發育完全的胞飲突；丹參酮ⅡA高劑量組呈現較多發育中或發育完全的胞飲突。圖1 掃描電鏡下觀察胞飲突在子宮內膜的表達情況(×2 000)

二、丹參酮ⅡA對子宮內膜LIF、Ang-2和VEGF表達的影響

采用Western blot檢測子宮內膜LIF、Ang-2和VEGF表達情況，結果顯示，與正常對照組相比，模型組中LIF、Ang-2和VEGF表達均顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA低劑量組和丹參酮ⅡA高劑量組LIF、Ang-2和VEGF表達均顯著增加(P<0.05)(圖2)。

A：LIF、Ang-2及VEGF蛋白表達條帶圖；B：LIF蛋白相對表達水平；C：Ang-2蛋白相對表達水平；D：VEGF蛋白相對表達水平。與正常對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖2 丹參酮ⅡA對子宮內膜組織LIF、Ang-2及VEGF表達量的影響

三、丹參酮ⅡA對子宮內膜組織TGF-β1表達量的影響

采用免疫組化染色法檢測TGF-β1在子宮內膜組織中的表達情況。結果顯示，相較于正常對照組，模型組中TGF-β1表達水平顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA低劑量組和丹參酮ⅡA高劑量組中TGF-β1表達水平均顯著降低(分別為P<0.05和P<0.01)(圖3)。

A：各組大鼠子宮內膜植入位點組織中TGF-β1免疫組化染色結果(×40)；B：各組大鼠子宮內膜植入位點組織中TGF-β1表達水平比較。與正常對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖3 丹參酮ⅡA對子宮內膜植入位點組織TGF-β1表達量的影響

四、丹參酮ⅡA對子宮內膜組織炎性介質LXA4、IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-4表達的影響

ELISA檢測結果顯示，與正常對照組相比，LXA4、IL-1α、IL-1β和IL-6水平在模型組中顯著增加(P<0.01)，而IL-4水平在模型組中顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，LXA4、IL-1α、IL-1β和IL-6水平在丹參酮ⅡA低劑量組和丹參酮ⅡA高劑量組中均顯著降低(P均<0.05)，而IL-4水平在丹參酮ⅡA低劑量組和丹參酮ⅡA高劑量組中均顯著升高(P均<0.05)(圖4)。

A：LXA4表達水平；B：IL-1α表達水平；C：IL-1β表達水平；D：IL-6表達水平；E：IL-4表達水平。與正常對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖4 丹參酮ⅡA對子宮內膜組織炎癥相關因子表達的影響

五、丹參酮ⅡA對子宮內膜TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響

Western blot結果顯示，相較于正常對照組，TLR4、MyD88、p-p65表達水平在模型組中均顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，TLR4、MyD88、p-p65表達水平在丹參酮ⅡA低劑量組和丹參酮ⅡA高劑量組中均顯著降低(P<0.05)(圖5)。

六、丹參酮ⅡA對子宮內膜組織p65表達的影響

免疫組化檢測子宮內膜組織p65的表達，結果顯示，與正常對照組相比，p65在模型組中表達顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，p65在丹參酮ⅡA低劑量組和丹參酮ⅡA高劑量組中均顯著降低(P<0.05)(圖6)。

A：p-p65、MyD88及TLR4蛋白表達條帶圖；B：TLR4蛋白表達水平；C：MyD88蛋白表達水平；D：p-p65蛋白表達水平。與正常對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖5 丹參酮ⅡA對子宮內膜TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響

A：各組大鼠子宮內膜植入位點組織中p65免疫組化染色結果(×40)；B：各組大鼠子宮內膜植入位點組織中p65表達水平比較。與正常對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖6 丹參酮ⅡA對子宮內膜植入位點組織p65表達的影響

討 論

不孕不育是一個世界性問題，據估計其影響發達國家和發展中國家多達30%的夫婦[15]。在這項研究中，我們建立了著床障礙模型大鼠，從實驗角度進一步探究丹參酮ⅡA對大鼠著床窗期子宮炎癥微環境及子宮內膜容受性的影響，并闡明其作用機制。在給予丹參酮ⅡA后，我們發現子宮內膜胞飲突數量增加，使得子宮內膜容受性的下降得到了逆轉，且子宮內膜容受性關鍵調節因子LIF的表達顯著增加，胞飲突的出現與子宮內膜容受性標志物的表達結果一致。據報道，LIF作為促植入細胞因子，對胚胎正常植入至關重要[16-17]。此外，在精漿-子宮內膜相互作用過程中，上皮細胞表達增殖、分化和蛻膜相關基因，子宮內膜細胞分泌炎癥因子、生長因子、細胞因子，包括LIF、VEGF和Ang-2等[16，18-19]。血管形成為胎兒和子宮內膜之間進行營養、氣體和代謝物質的交換創造了適當的環境，這一過程受到諸多互補和復雜的信號因子的嚴格控制。其中最突出的是VEGF，早期研究表明，VEGF的表達對于增加著床率具有重要影響[20]；其他研究表明，Ang-2以時空方式在著床窗期子宮內膜中表達，并參與血管生成和血管重塑過程[21]；此外，Ang-2還是改善子宮內膜容受性的重要因素[21]。我們的實驗結果顯示，丹參酮ⅡA增加了著床障礙模型大鼠子宮內膜Ang-2及VEGF的表達，提示丹參酮ⅡA可以改善著床窗期子宮內膜血管生成和血管重塑，可作為提高子宮內膜容受性的有效方劑之一。

此外，炎性微環境是影響胚胎著床和妊娠維持的一個關鍵因素[22]；炎癥反應會改變子宮內膜容受性[23]。胚胎著床是一個復雜的過程，子宮的炎癥環境在著床和妊娠期間從促炎狀態變為抗炎狀態，胚胎植入過程中需要有強烈的炎癥反應[24]。有報道稱，VEGF的表達受多種生長因子和細胞因子的調控，如TGF-β1、IL-1α、IL-6等[25]。此外，子宮組織炎癥介質LXA4是一種能干擾胚胎著床窗口期子宮內膜局部炎癥微環境的抗炎介質，可調節早期妊娠的子宮內膜和蛻膜中的炎癥事件，多項研究認為其參與子宮內膜相關疾病的進展[26-27]。在本研究中，胚胎著床障礙后，子宮內膜產生大量LXA4，而丹參酮ⅡA則抑制了LXA4的產生，表明丹參酮ⅡA能減輕LXA4的抗炎作用，促進炎性因子的釋放，使種植窗期子宮內膜保持一定的炎性環境，有利于改善子宮內膜容受性，這與前面的報道[24]一致。此外，子宮內膜著床障礙后，子宮內膜產生促炎因子如IL-1α、IL-1β、IL-6等[28]，同時還會抑制抗炎因子如IL-4等[29]，丹參酮ⅡA治療則逆轉了這些因子的變化，說明丹參酮ⅡA在體內可調節子宮炎性微環境，減輕炎癥。

TLR4信號通路已被廣泛研究，可通過MyD88介導的NF-κB激活發揮其作用[30]。作為轉錄因子，NF-κB已被證實與炎癥激活密切相關[31]；此外TLR4信號相關的炎癥激活與胚胎植入密切相關[32]。NF-κB家族有5個成員，其中p65是NF-κB家族中的重要亞型，通常狀態下，NF-κB異二聚體可與其抑制蛋白IκB結合形成復合體存在于細胞漿中。當NF-κB通路被激活后，磷酸化的p65蛋白(p-p65)可被釋放后轉運入核，啟動下游基因轉錄，因此，p-p65可作為NF-κB通路激活的標志。NF-κB信號通路在許多生物過程中起著關鍵作用，包括子宮內膜相關炎癥[24]。值得注意的是，NF-κB信號通路與TGF-β1在炎性微環境形成中的表達存在相關性，促炎細胞因子IL-1β可通過激活NF-κB通路、促進p65向核易位并結合TGF-β1啟動子誘導慢性炎癥疾病中TGF-β1表達[33]。我們的結果顯示，丹參酮ⅡA能明顯抑制TLR4、MyD88及p-p65的表達，并抑制NF-κB亞單位p65的表達，從而抑制p65的轉錄激活域，抑制靶基因的轉錄。表明丹參酮ⅡA可通過干擾TLR4/MyD88/NF-κB信號通路進一步改善子宮炎性微環境進而改善著床障礙模型大鼠著床窗期子宮內膜容受性，但這一假設仍需要進一步研究加以驗證。

綜上，丹參酮ⅡA可以改善子宮內膜容受性，其機制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，豐富子宮內膜胞飲突的表達，改善子宮炎性微環境，提高LIF、Ang-2、VEGF和IL-4等細胞因子的表達有關。然而，由于子宮內膜容受性的建立過程復雜，涉及眾多細胞因子和基因共同參與，本研究僅選取部分機制進行探索，未來仍需更深入的研究加以探討。