茶多糖含量的快速測定方法

張子玉，汪東風，范明昊，吳 姝，裴登邑，汪曙暉

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003；2.青島市疾病預防控制中心，山東青島 266005）

茶含有多種生物活性物質，如茶多酚、茶多糖（Tea Polysaccharides，TPS）、茶色素、茶氨酸、維生素和礦物質等[1]。TPS是從茶葉中提取出來的與蛋白質結合在一起的一種雜多糖復合物，具有降血脂、降血糖、增強免疫力、抗輻射、降血壓、抗血凝和抗血栓等功效[2-4]，尤其以降血糖作用突出[5]，極具應用和開發(fā)前景，可廣泛應用于食品、醫(yī)藥、保健等領域[6]。因此，定量分析TPS成為控制其質量和將其開發(fā)為功能食品的關鍵步驟之一[7]。

目前，測定多糖含量的方法主要有分光比色法[8]、高效液相色譜法[9]、酶法[10]等。采用高效液相色譜法與酶法測定時樣品前處理工序比較煩瑣，測定時間較長，且檢測費用較高，不便快速測定。傳統(tǒng)的分光比色法通常以葡萄糖或其他單糖作為標準物質，如《枸杞多糖》（QB/T 5176—2017）中以葡萄糖作為標準物質[11]。但由于TPS是一種有蛋白質結合的雜多糖復合物，采用葡萄糖作為標準物質與真實值偏差較大[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，用綠茶及烏龍茶的TPS作為苯酚-硫酸反應的多糖標準品，與葡萄糖作標準品的苯酚-硫酸法，通過校正系數(shù)2.038，可建立一種簡便、快速、可靠的測定綠茶和烏龍茶中TPS含量的理想方法[12]。傅博強等[13]對江西婺源不同茶場茶葉中多糖的含量進行了測定，用精制TPS測得TPS對葡萄糖的校正系數(shù)，不同茶葉品種的校正系數(shù)均不相同，婺源紅碎茶為3.961、婺源綠茶為4.268、福建安溪烏龍為4.272。張星海等[14]建立一種茶樹花多糖含量的校正系數(shù)蒽酮-硫酸檢測方法，結果以半乳糖為標準對照品時校正系數(shù)f半乳糖=2.84，以葡萄糖為標準對照品時校正系數(shù)f葡萄糖=4.49。上述校正系數(shù)的不同，可能與不同的茶葉種類的工藝對其單糖、雙糖、低聚糖等含量有影響，從而影響其TPS對葡萄糖的校正系數(shù)[15]。

測定茶葉TPS時，提取方法不盡相同，陳建國等[16]采用直接水提法進行測定，也有研究者們采用50%～80%乙醇水溶液除去游離糖后進行水提測定[17-20]，《竹葉中多糖的檢測方法》（GB/T 40632— 2021）[21]采用水提后95%醇沉法進行樣品多糖測定，此外參考《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚-硫酸法》（SN/T 4260—2015）檢測方法[22]，考慮到方法快速準確性，通過比較水提法和80%乙醇清洗水提法的差異，對茶葉中TPS的測定進行優(yōu)化，為合理開發(fā)、利用茶葉中TPS資源提供幫助，同時使測定茶葉樣品中TPS含量的方法更準確、穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 儀器

BSA124S電子天平[賽多維斯科學儀器（北京）有限公司]、SHA-C恒溫振蕩器（常州國華儀器有限公司）、GL-20B型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）、1260系統(tǒng)高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、多功能酶標儀SpectraMax iD3[美谷分子儀器（上海）有限公司]、手提式高速粉碎機DFT-50A（上海左樂儀器有限公司）、250 mL容量瓶、10 mL具塞試管等。

1.1.2 試劑與材料

市場收購曬青綠茶加TPS及未加TPS的茶餅，云南綠鑫茶業(yè)公司產曬青綠茶加TPS及未加TPS茶餅、白茶加TPS及未加TPS茶餅，云南彤瑞茶葉公司產于2017年的普洱熟茶餅及2022年的普洱熟茶餅，上述茶樣分別編號為1～8；夏季云南大葉種茶樹粗老葉，曬干備用；D-無水葡萄糖標準品[Merck（德國）]、苯酚、濃硫酸和乙醇均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 TPS的提取及純化

以夏季云南大葉種茶樹粗老葉為原料，參考FAN的方法[23]，使用蒸餾水在80 ℃下提取夏季云南大葉種茶樹粗老葉的TPS 1.5 h，并重復兩次。離心去除污染物。通過旋轉蒸發(fā)法濃縮上清液。添加80%的乙醇水溶液，通過過濾分離沉淀，再溶解在水中，重復沉淀和再溶解兩次。用無水乙醇、丙酮和乙醚交替洗滌純化的沉淀以除去小分子，并重復兩次。將沉淀溶解在水中，并用適量交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮處理以去除蛋白質和多酚，離心。冷凍干燥上清液，得到粗TPS粉末，將TPS粉末配制成濃度為2.00 mg·mL-1的溶液，以1.50 BV·h-1的速度上樣于預先處理填充好的D315樹脂層析柱。用蒸餾水洗脫，將流出液與蒸餾水洗脫液合并，50 ℃旋蒸濃縮，透析3 d，每6 h更換一次蒸餾水，冷凍干燥得到純化的TPS。

1.2.2 TPS檢測色譜條件

在配有RID型折射率檢測器和TSK G3000PW柱（7.8 mm×30.0 cm）的1260系統(tǒng)高效液相色譜儀（美國Agilent公司）上測試粗TPS及純化的TPS的純度。檢測器及柱子溫度設置為30 ℃，IR的測量范圍設置為32 AUFS，0.5 mL min-1水中洗脫。

1.2.3 標準溶液的配制及標準曲線的繪制

準確稱取105 ℃干燥恒重的D-無水葡萄糖標準品和純化的TPS 0.01 g，采用苯酚-硫酸法構建標準曲線[7]。

1.2.4 樣品溶液的制備及測定

參考文獻[17-20]用80%乙醇溶液洗茶，再水提的方法提取TPS待測樣，具體方法如下：準確稱取0.4 g（精確到0.000 1 g）勻質樣品粉末于250 mL錐形瓶中，加入20 mL體積濃度80%的乙醇水溶液，振蕩混勻，置超聲波提取器中超聲提取30 min，再以 3 000～4 000 r·min-1離心10～20 min，移除上清液；以離心所得的殘渣替代上述待測樣品，重復2～3次，以除去可溶性單糖及低聚糖部分，殘渣用熱水洗至原錐形瓶中，加沸蒸餾水100 mL，立即移入沸水浴中，磁力攪拌浸提45 min，浸提完畢后立即趁熱減壓過濾，殘渣用少量熱蒸餾水洗滌2～3次，將濾液移入 250 mL容量瓶中，冷卻后用水定容至刻度，搖勻，按標準曲線方法測定。

參考文獻[16]中采用直接水提法制備TPS待測樣，具體方法如下：準確稱取0.4 g（精確到0.000 1 g） 勻質樣品粉末于250 mL錐形瓶中，加沸蒸餾水 100 mL，立即移入沸水浴中，磁力攪拌浸提 45 min，浸提完畢后立即趁熱減壓過濾，殘渣用少量熱蒸餾水洗滌2～3次，將濾液移入250 mL容量瓶中，冷卻后用水定容至刻度，搖勻，按標準曲線方法測定。

按照標準曲線測定方法測定吸光度，采用標準曲線法計算樣品中多糖的含量。樣品中TPS含量為

式中：w為樣品中TPS含量，%；m1為從標準曲線上查得樣品測定液中的TPS含量，μg；v1為樣品定容體積，mL；m2為樣品質量，μg；v2為比色測定時移取樣品測定液的體積，mL。

1.2.5 校正系數(shù)的測定

準確稱取純化的TPS 0.01 g，用水定容至100 mL。采用苯酚-硫酸比色法測定其吸光度，由標準曲線求出此純化的TPS貯備液中葡萄糖質量濃度，按下式計算校正系數(shù)（f）為

式中：m為稱取純化的TPS的質量，mg；C為純化的TPS貯備液中葡萄糖質量濃度，mg·mL-1；D為TPS溶液稀釋因子。

1.2.6 加標回收率、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

精密稱取已知濃度的勻質樣品粉末0.4 g（精確到0.000 1 g），分別放入250 mL錐形瓶中，精密加入純化的TPS對照品40.0 mg，按1.2.2、1.2.3方法制備樣品溶液，測定吸光度，計算回收率以及相對標準偏差（RSD值）。在結束反應冷卻后不同的時間間隔（0 h、0.5 h、1.0 h）對TPS含量進行分析，以檢驗方法的穩(wěn)定性。取6份1號樣本用1.2.4樣品溶液制備中80%乙醇清洗水提法分別單獨制備，以測試其重復性。

1.2.7 數(shù)據處理

實驗結果表示為平均值±標準差；采用IBM SPSS Statistics 25軟件進行統(tǒng)計學分析，利用OriginPro 2019b繪制色譜圖及標準曲線圖。

2 結果與分析

2.1 粗TPS及純化TPS的色譜圖

由圖1可知，經高效液相色譜法檢測純化TPS為明顯一單峰，表明該TPS純度高。

圖1 粗TPS及純化TPS在HPLC上的色譜圖

2.2 標準曲線及樣品中多糖含量

以490 nm處的吸光度為y軸，以TPS的含量為x軸，構建一條回歸線。得到葡萄糖標準曲線y=0.009 4x+0.089 6，R2=0.997 8，TPS標 準 曲 線y=0.005x+0.079 5，R2=0.997 0(圖2)。從圖2可看出選擇葡萄糖作為標準曲線會導致TPS含量較實際值偏小，使測得樣品的TPS含量偏低，使用TPS標準曲線則可以避免。

圖2 苯酚-硫酸法建立葡萄糖與TPS在490 nm處的標準曲線

采用葡萄糖與純化的TPS標準曲線進行樣品中TPS含量的計算，樣品直接用水提法測TPS含量結果如表1，經過80%乙醇水溶液洗后水提法測多糖含量結果如表2。結果表明，以純化的TPS作為標準物質，可降低葡萄糖作為標準物質引起的偏差，這與WANG[12]的研究結果一致。此外，通過80%乙醇水溶液洗后水提法測得的TPS含量與水提法測得的TPS含量差異明顯，這說明先用80%乙醇超聲提取可除去單糖、雙糖、低聚糖、甙類、生物堿、茶多酚、氨基酸及醇溶性蛋白等干擾性成分，再用水提取其中所含的TPS，使TPS含量測定不受干擾性成分的影響，這與GIANNOCCARO[17]的研究結果 一致。

表1 樣品水提TPS含量

表2 樣品醇洗水提TPS含量

2.3 校正系數(shù)

因TPS是一種復合物，糖部分僅是其組成成分之一[24]，以純化的TPS作為標準物質，由1.2.5校正系數(shù)公式求得校正系數(shù)為1.95，以避免葡萄糖作為標準物質引起的檢測值偏低。通過葡萄糖為標準曲線計算出樣品醇洗水提TPS含量結果為4.45%、4.04%、2.82%、2.01%、3.43%、3.07%、3.68%和3.49%，再乘校正系數(shù)1.95以校正結果，為8.68%、7.88%、5.50%、3.92%、6.69%、5.99%、7.18%和6.80%，可看出結果與直接使用純化的TPS標準曲線計算出的結果極為接近，說明使用校正系數(shù)可對以葡萄糖為標準曲線計算出的含量進行較好地校正。這比傅博強等[13]采用不同茶葉品種、不同產地進行TPS檢測方法得到的校正系數(shù)紅碎茶3.961，綠茶4.220較低。WANG[12]提取綠茶及烏龍茶的TPS，同時用苯酚-硫酸法建立葡萄糖與TPS在490 nm處的標準曲線得到校正系數(shù)2.038，因綠茶及烏龍茶與原料本身更為接近，因此得出的校正系數(shù)較為可靠。本實驗通過茶葉未加工原料修剪枝葉提取TPS，結果得到校正系數(shù)與周小玲[7]極為接近，可避免不同的茶葉種類及工藝對其單糖、雙糖、低聚糖等含量的 影響。

2.4 加標回收率、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

水提法及80%乙醇洗水提法加純化的TPS對照品的回收率實驗結果見表3、表4，水提法平均回收率為98.74%，RSD為1.81%，80%乙醇洗水提法平均回收率為98.26%，RSD為3.05%，說明平均回收率不受TPS提取方法的影響，且該方法具有較高的準確度。

表3 樣品水提TPS回收率

表4 樣品醇洗水提TPS回收率

方法穩(wěn)定性及重現(xiàn)性實驗結果，待測液在結束反應冷卻后0 h、0.5 h、1.0 h再次測定其吸光度，并計算TPS含量，以確定方法的穩(wěn)定性，從表5可看出，反應結束顯色基本穩(wěn)定，RSD值為1.36%。取6份1號樣本用1.2.4樣品溶液制備中80%乙醇清洗水提法分別單獨制備，評價該方法的重復性，RSD值為3.01%，如表6。

表5 方法穩(wěn)定性

表6 方法重復性

3 結論

為快速檢測TPS含量，本文對茶葉中TPS水提法和80%乙醇水洗后水提法的差異進行了比較，并同時用D-無水葡萄糖標準品和純化的TPS作為標準品測定茶葉中TPS含量。先用兩種提取方法進行TPS提取，再利用D-無水葡萄糖標準品和純化的TPS作為標準品分別得到標準曲線，利用標準曲線計算TPS含量，確定葡萄糖標準品對純化的TPS標準品的校正系數(shù)為1.95，檢測方法學考察表明該檢測方法的穩(wěn)定性好（RSD=1.36%），重復性強（RSD=3.01%），加標回收率較高（平均回收率=98.26%±3.00%），方法準確度較高。用校正系數(shù)計算樣品中TPS含量，結果分別為8.68%、7.88%、5.50%、3.92%、6.69%、5.99%、7.18%和6.80%，使結果更接近于使用純化TPS的測定值。

因此，使用茶樹粗老葉提取純化的TPS作標準品，80%乙醇水洗后水提法制備測試液，用苯酚-硫酸法快速測定，可作為不同茶葉樣品TPS含量的簡便測定方法。