液相色譜質譜聯用測定中毒樣品中河豚毒素

高榕冬，孫磊龍，章敏敏，彭 驄

（揭陽市疾病預防控制中心，廣東揭陽 522000）

河豚在世界各地均有分布，我國河豚種類多達40余種，分布在沿海一帶。由于河豚具有肉質鮮美、營養豐富等特點，我國在很早以前就有食用河豚的習俗。日本、韓國等國家將河豚魚加工成各式料理直接食用。河豚魚某些器官組織中具有毒性很強的河豚毒素，若誤食河豚毒素，毒素將作用于人的中樞及外周神經系統，從而導致神經肌肉麻痹，嚴重的會導致誤食者死亡。在我國沿海地區時常會出現河豚毒素中毒事件，同時海豚毒素所具有的劇毒特性在軍事、醫學等領域也具有十分廣泛的應用。目前河豚毒素檢測有生物測定法、免疫化學法、儀器分析法等，但是這些檢測方法各有優缺點，不能很好地滿足河豚毒素的法醫鑒定、臨床診斷救治、食品安全監控等要求[1-3]。隨著液相色譜-質譜聯用測定技術的不斷成熟，將該技術應用于中毒樣品中河豚毒素的測定，可以有效滿足實際需求[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河豚毒素標準品（純度為99.3%，Aifa Scientific Co）。甲醇（色譜純），德國默克；乙腈（色譜純），德國默克；甲酸（優級純），阿拉丁科技有限公司；乙酸（優級純），廣州化學試劑廠；乙酸銨（優級純），廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

SCIEX 5500+液相色譜質譜聯用儀，美國SCIEX，技術指標如表1、表2所示。PT-MR2100均質機，德國IKA；MSI旋渦混勻器，德國IKA；H2050R醫用離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

表1 SCIEX 5500+液相色譜質譜聯用儀液相技術指標表

表2 SCIEX 5500+液相色譜質譜聯用儀質譜技術指標表

1.3 試驗方法

1.3.1 配制工作溶液

選取1 mg的河豚毒素對照品，用甲醇進行溶解配制成標準溶液，溶液濃度為100 mg·L-1，同時將標準溶液放置在4 ℃的冰箱內存放。將河豚毒素標準溶液分別加入到空白的魚肉與魚肝中，獲得質量分數為0.1～10.0 mg·kg-1實驗樣品，按照樣品處理的方式進行處理，然后進行液相色譜-質譜聯用測定河豚毒素。

1.3.2 樣品前處理

（1）河豚魚。①用天平稱取2.0 g魚肉或者魚肝樣品，將樣品切碎放置到50 mL的離心管中，同時加入5 mL甲酸-甲醇溶液（1+99）攪拌均勻。②將其放入80 ℃的水浴鍋中加熱10 min，選擇離心速度為10 000 r·min-1的離心機離心5 min，同時用吸管吸取上層的清液2.5 mL。③對溶液的pH值進行調整，確保溶液pH在6～8，同時在溶液中加入40 mg的木瓜蛋白酶。④將溶液進行充分混合之后放置到55 ℃的水浴中進行水解2 h。離心速度為10 000 r·min-1的離心機中離心10 min，然后采用吸管吸取上層的清液2 mL，將其放置到另外一個離心管中。在該離心管中加入2 mL的石油醚并振蕩30 s，進行離心操作將有機相舍棄。⑤將1 mL的樣品提取液上樣到經過甲醇和水活化后的固相萃取柱后，依次采用3 mL的水溶液、3 mL的甲醇溶液淋洗萃取柱。通過真空抽取的方式來抽干萃取柱1 min，然后采用3 mL含有2%三氟乙酸的水溶液進行洗脫處理。⑥采用吸管吸取 2 mL洗脫液，經過旋轉蒸發儀蒸干之后，用1 mL的甲酸-甲醇溶液（1+9）溶解殘渣，用0.22 μm的濾膜進行過濾處理，最后對處理后的溶液進行液相色譜-質譜聯用分析。

（2）血樣。全血樣于冷凍離心機離心3 min，取上層血清（或血漿）0.1 mL至塑料離心管中，加入 0.9 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，于冷凍離心機 10 000 r·min-1離心5 min，上清液全部轉移至另一塑料離心管，下層加入0.9 mL乙腈再提取1次，合并乙腈層，提取液置于40 ℃氮吹儀上吹干，準確加入0.50 mL乙腈復溶剩余物，過0.22 μm濾膜后上液相色譜-質譜聯用儀分析。

（3）尿樣。靜置，過0.22 μm濾膜后直接上液相色譜-質譜聯用儀分析。

（4）洗 胃 液/嘔 吐 物。洗 胃 液/嘔 吐 物 于 5 000 r·min-1離心3 min，取上清液2 mL，加適量氯化鈉，加2 mL乙腈，以下前處理步驟同血樣處理。

1.4 色譜-質譜條件

（1）色譜條件。色譜柱選擇Phenomenex Kinetex C18（100 mm×3.0 mm，2.6 μm），流動相的流速為 0.2 mL·min-1，色譜柱室溫范圍為20～25 ℃，進樣量為5 μL，表3為梯度洗脫程序。

表3 梯度洗脫程序

（2）質譜條件。質譜條件為電噴霧正離子源，電離電壓為4.5 kV，毛細管的溫度為350 ℃，碰撞的能量為25 eV，鞘氣流為1.4 bar，輔助氣流為 0.003 L·min-1，采用MS1、MS2、MS3全掃描質譜儀進行分析。在上述色譜、質譜條件下對質譜參數進行優化，將河豚毒素的母離子與兩個子離子組成兩對母離子/子離子對，具體如圖1所示。

圖1 河豚毒素二級質譜圖

2 結果與分析

2.1 樣品處理方式選擇

一般而言，含復雜基質樣品并不能直接進行液相色譜質譜分析，必須經過處理將樣品中的內源性蛋白、脂質、鹽類等各種雜質去除。目前對生物樣品的處理主要有液液萃取、固相萃取、蛋白質沉淀等方法，考慮到河豚毒素具有比較強的極性，不溶于弱極性有機溶劑，能溶于pH值為3～7的弱酸性水溶液，因此采用固相萃取的方式來對含復雜基質樣品進行預處理。采用固相萃取對生物樣品進行前處理主要包括選擇蛋白沉淀劑、確定蛋白沉淀劑和樣品的比例等多個方面的內容，通過科學選擇蛋白沉淀劑以及合理確定蛋白沉淀劑與樣品的比例來優化樣品處理方法。通過比較不同沉淀劑對蛋白的沉淀效果，發現1%的甲酸甲醇溶液沉淀效果最好；血樣、尿液、胃液可通過靜置、離心、乙腈提取的方法得到較滿意的結果。

2.2 色譜柱選擇

河豚毒素分子結構特點具有比較高的極性和水溶性，如果采用離子對色譜法進行分離，就無法使用液相色譜-質譜聯用分析儀，方法中采用由美國菲羅門公司生產的Kinetex系列C18的液相色譜柱，該色譜柱具有更高的靈敏度和分離度，線性速度和耐壓范圍更寬，對各種生物性樣品，如血液、尿液、胃液等具有更強的適應性。通過一定比例的梯度洗脫程序，能夠有效使得親水性物質和雜質做到完全分離。實際的實驗結果表明選擇Phenomenex Kinetex能夠取得良好的效果。

2.3 河豚毒素測定方法選擇

在空白血液中添加10 ng·mL-1河豚毒素，對添加河豚毒素的空白血液進行多反應監測，獲得多反應監測色譜圖，如圖2所示。

圖2 多反應監測色譜圖（空白血液添加10 ng·mL-1河豚毒素）

用吸管吸取空白的血液和尿液，對血液和尿液樣品進行預處理，并進行空白血液和尿液的多反應監測，獲得多反應監測色譜圖，如圖3所示。由圖3可知，空白血液河豚毒素出現波峰的地方（2 min處），檢測色譜強度比較大，未出現比較大的響應；空白尿液河豚毒素出現波峰的地方（7 min處），檢測色譜強度比較大。由此可知空白基質不會產生干擾，河豚毒素測定方法選擇是良好的。

2.4 線性關系

在空白的血液、尿液、胃液中加入適量的河豚毒素，將其配制成含有河豚毒素2～100 ng·mL-1的血液、尿液、胃液樣品，并且對血液、尿液、胃液樣品進行分析處理。以河豚毒素含量作為橫坐標，峰面積作為縱坐標，對峰面積y與河豚毒素含量x之間的關系采用最小二乘法進行回歸分析。定義檢出限為河豚毒素定性離子對峰強度信噪比大于3的含量，定量限為河豚毒素定性離子對峰強度信噪比大于10的含量。表4為血液、尿液、胃液3種基質中河豚毒素測定結果。由表4可知，血液、尿液、胃液中河豚毒素在線性范圍內具有良好的線性關系，能夠有效滿足對生物檢材河豚毒素測定的分析 要求。

表4 血液、尿液、胃液3種基質中河豚毒素測定結果

2.5 精密度分析

在化學實驗中多次測定值之間的接近程度被稱為精密度，通過精密度能夠有效反映測定結果重現性的優良。為了對中毒樣品中河豚毒素測定精密度分析，分別在空白血液、尿液、胃液中加入適量的河豚毒素，配制成含有河豚毒素的低質量濃度（8 ng·mL-1）的血液、尿液、胃液，含有河豚毒素的中質量濃度 （50 ng·mL-1）的血液、尿液、胃液，含有河豚毒素的高質量濃度（80 ng·mL-1）的血液、尿液、胃液各10份，并且對不同質量濃度的血液、尿液、胃液進行預處理。根據當天標準曲線來計算不同樣品中的河豚毒素含量，獲得10份樣品的相對標準偏差，將其作為日內精密度值。采用同樣的實驗方法重復測定3 d，計算相對標準偏差，將該數值作為日間精密度值，實驗結果如表5所示。

表5 血液、尿液、胃液3種基質河豚毒素精密度

由表5可知，不論是血液、尿液還是胃液，伴隨著河豚毒素添加量的增加，其日內精密度值和日間精密度值均呈現下降的趨勢，即生物基質中河豚濃度越高，其多次測定值之間的接近程度越高；生物基質中河豚毒素濃度越低，其多次測定值之間的接近程度越低。

2.6 回收率與基質效應

采取和精密度分析一樣的方法來制備血液、尿液、胃液，并對制備的樣品進行預處理。采用液相色譜質譜聯用分析儀測定河豚毒素的峰值面積A1，相同基質的空白樣品經過預處理后，在經溶劑吹干的殘留物中加入河豚毒素對照品，制備相應質量濃度的溶液，采用液相色譜質譜聯用分析儀測定河豚毒素的峰值面積A2，那么提取回收率為

另外，取相同量的對照品溶液吹干，采用流動相定容法進行采樣，通過液相色譜質譜聯用分析儀測定目標物的峰面積A3，那么基質效應為

河豚毒素具有相對比較強的極性，其只能溶于弱酸性的水溶液，這使得不同生物樣品的雜質溶得比較多，從而出現比較大的基質抑制效應，詳見表6。另外，在蛋白沉淀的過程中河豚毒素的溶解性相對比較差，很容易被已經沉淀的蛋白質雜質吸附，這也將對河豚毒素的提取回收率產生一定的影響。

表6 血液、尿液、胃液3種基質河豚毒素的回收率與基質效應

3 結論

河豚毒素作為小分子化合物中劇毒的非蛋白質神經毒素，在多種海洋生物體中廣泛存在。本文通過對血液、尿液、胃液、魚樣等生物樣品進行靜置離心、乙腈提取、固相萃取等方法處理，采用Phenomenex Kinetex C18色譜柱進行分離，構建了采用液相色譜質譜聯用儀測定河豚毒素的方法。該方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便快捷等優點，為生物材料以及各種水產品中河豚毒素的測定提供科學依據。