不同年齡女性D3卵裂期胚胎細胞數對囊胚發育潛能的影響

李曉艷，許娟娟，伏海燕，王慧，吳蓉花，林瑩，黃夢婷，黃旋，陳莉

(中國人民解放軍東部戰區總醫院生殖醫學科，南京 210002)

隨著胚胎序貫培養水平的提高，囊胚培養技術日趨成熟。囊胚培養越過了胚胎基因組激活階段，經歷了細胞融合、囊腔的形成與擴大，并淘汰了一些發育潛能較差的胚胎。囊胚移植還有利于增加子宮內膜和胚胎發育的同步性，因此囊胚移植周期的臨床妊娠率和著床率有顯著升高[1]。但是囊胚培養也有培養失敗的風險，一般囊胚形成率為40%～60%，長時間的培養和篩選過程，可能會導致患者無可移植囊胚，給患者造成經濟和心理負擔。更重要的是體外培養時間延長也可能對印記基因有一定影響，從而影響子代遠期安全[2]。因此現階段絕大多數生殖中心在胚胎培養的第3天(D3)選擇卵裂期胚胎移植或冷凍，剩余胚胎行囊胚培養。眾所周知，女方年齡越大胚胎非整倍體率越高，囊胚形成率越低。胚胎發育速度與整倍體率和囊胚形成率密切相關，D3卵裂期胚胎細胞數可反映胚胎發育速度的快慢[3]。女方不同年齡階段的D3卵裂期胚胎細胞數對囊胚形成及妊娠結局的影響報道較少。本研究根據不同女方年齡進行分組，旨在研究不同年齡階段不同細胞數的卵裂期胚胎對囊胚形成及移植結局的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2015年1月至2021年12月在東部戰區總醫院生殖醫學科行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療患者的臨床資料。本研究分為3部分。

研究1：比較D3卵裂期胚胎不同細胞數對囊胚發育潛能的影響。納入/排除標準：D3移植或冷凍后，剩余行囊胚培養的卵裂期胚胎；卵裂期胚胎均為≥Ⅲ級胚胎；卵裂期胚胎為正常受精(2PN)來源；卵裂期胚胎細胞數≥4，碎片率<50%；排除卵子冷凍復蘇周期。

研究2：比較不同細胞數D3胚胎來源的囊胚對單囊胚移植結局的影響，其囊胚的D3卵裂期情況納入/排除標準同研究1。囊胚移植的納入/排除標準：行凍融單囊胚移植的患者；排除子宮畸形、子宮器質性病變、生殖道畸形等患者。

研究3：比較不同細胞數D3胚胎對所形成囊胚的整倍體率的影響，其囊胚D3卵裂期情況納入/排除標準同研究1。胚胎植入前非整倍體檢測(PGT-A)納入標準：不明原因反復自然流產；不明原因反復種植失敗；因女方高齡(≥38歲)需要做整倍體檢測的患者。排除標準：因活檢細胞數不足或擴增失敗導致無法檢測或檢測失敗的胚胎；夫妻一方患有單基因病。

二、研究分組

研究1：共納入行囊胚培養的29 314枚D3卵裂期胚胎。按女方年齡分為<35歲組(n=23 778)和≥35歲組(n=5 536)兩組；兩組中再根據D3卵裂期胚胎細胞數分為4細胞、5細胞、6細胞、7細胞、8細胞、9細胞、10細胞、11+細胞、融合期胚胎9個亞組。分析不同年齡組不同細胞數D3胚胎的囊胚培養結局。

研究2：共納入2 402個單囊胚移植周期。按女方年齡分為<35歲組(n=1 887)和≥35歲組(n=515)兩組；兩組中再根據囊胚來源的D3胚胎細胞數不同分為3個亞組，分別是4～6細胞、7～9細胞和≥10細胞+融合期。分析不同年齡組不同細胞數D3胚胎所形成的囊胚的凍融單囊胚移植結局。

研究3：共納入1 069個行PGT-A檢測的囊胚。按女方年齡分為<35歲組(n=609)和≥35歲組(n=460)兩組；兩組中的亞細胞分組同研究2。分析不同年齡組不同細胞數D3胚胎對所形成囊胚的整倍體率的影響(研究2與研究3的數據均篩選于研究1)。

三、診療回顧

2.胚胎質量評估：受精卵培養至D3，根據ASEBIR評分標準[4]進行形態學評分。根據卵裂期胚胎細胞數、碎片率、卵裂球大小均勻程度、是否有空泡以及透明帶狀況等將卵裂期胚胎進行等級評分，評為Ⅰ～Ⅳ級，其中Ⅰ～Ⅱ級可移植或冷凍，Ⅳ級胚胎丟棄。剩余胚胎行囊胚培養，培養至D5/D7，根據Gardner囊胚評分法[5]進行評分，≥3BC/3CB的囊胚進行囊胚冷凍。卵裂期胚胎和囊胚冷凍及解凍均按照加藤試劑盒(Kitazato，日本)使用說明書進行玻璃化冷凍和復蘇。

3.囊胚活檢：囊胚的觀察在D5～7進行，對所形成的可利用囊胚(≥3BC/3CB)予以活檢。活檢時，在遠離細胞團的位置將透明帶進行激光打孔，用活檢針緩緩吸取4～5枚滋養層細胞，激發3～4次激光切割細胞連接最薄弱處，使目標滋養層細胞與囊胚分離。取出的滋養層細胞置于PCR管中備檢。活檢細胞行遺傳學檢測，活檢后行單囊胚玻璃化冷凍。檢測結果為46，XN者為整倍體胚胎。

4.凍融囊胚移植：根據月經周期是否規律選擇內膜準備方案。對于月經周期規律的患者采用自然周期準備內膜；對于月經周期不規律的患者采用激素替代周期準備內膜。經陰道B超監測內膜厚度達到8 mm以上開始轉化內膜，同時陰道給藥行黃體支持，5 d后行囊胚移植。每周期移植1枚復蘇囊胚，移植后繼續黃體支持到孕11周。移植后4周行B超檢查，子宮腔內見孕囊或原始心管搏動為臨床妊娠。

5.隨訪：與孕期的患者保持電話隨訪。臨床妊娠率和活產率的統計日期截止到2021年7月13日。

四、觀察指標

囊胚形成率=(2期及以上的囊胚數/行囊胚培養的胚胎數)×100%；可利用囊胚形成率=(≥3BC/3CB的囊胚數/行囊胚培養的胚胎數)×100%；優質囊胚形成率=(≥3BB的囊胚數/行囊胚培養的胚胎數)×100%；臨床妊娠率=(超聲下能檢測到孕囊或胎心搏動的妊娠周期數/移植周期數)×100%；早期流產率=(孕周<12周的流產周期數/臨床妊娠周期數)×100%；整倍體率=(整倍體胚胎數/總活檢胚胎數)×100%。

五、統計學分析

結 果

一、D3不同細胞數卵裂期胚胎的囊胚培養結局

本研究共納入29 314個行囊胚培養的卵裂期胚胎。其中，<35歲組23 778枚，≥35歲組5 536枚。兩組根據行囊胚培養的卵裂期胚胎細胞數不同(4細胞、5細胞、6細胞、7細胞、8細胞、9細胞、10細胞、11+細胞、融合期胚胎)分為不同亞組比較各組的囊胚形成率、可利用囊胚形成率以及優質囊胚形成率(任意兩組之間均進行了比較)，且按照囊胚形成率對D3細胞數亞組進行了排序(表1)。

<35歲組中，8細胞亞組囊胚形成率、可利用囊胚形成率以及優質囊胚形成率均最高，與其他細胞數亞組比較差異顯著(P<0.05)；融合期胚胎亞組次之，11+細胞亞組囊胚發育潛能位居第三。各細胞數胚胎亞組囊胚發育潛能層次明顯，按照可利用囊胚形成率從高到低依次排序為：8細胞>融合期>11+細胞=9細胞>10細胞=7細胞>6細胞>5細胞=4細胞[>示前者顯著高于后者(P<0.05)，=示前后兩者間無顯著差異(P>0.05)](表1)。

表1 不同細胞數D3卵裂期胚胎的囊胚培養情況比較[n(%)]

≥35歲組中，8細胞亞組具有最好的發育潛能，優質囊胚形成率顯著高于融合期亞組(P<0.05)。融合期亞組發育潛能僅次于8細胞亞組，而9細胞亞組的囊胚形成率和優質囊胚形成率顯著高于10細胞亞組，7細胞亞組優質囊胚形成率顯著高于10細胞亞組(P<0.05)。各細胞數胚胎亞組按照可利用囊胚形成率從高到低依次排序為：8細胞=融合期>9細胞=7細胞=11+細胞=10細胞>6細胞=4細胞>5細胞[>示前者顯著高于后者(P<0.05)，=示前后兩者間無顯著差異(P>0.05)](表1)。

二、D3不同細胞數胚胎來源的囊胚凍融單囊胚移植結局

本研究共納入2 402個單囊胚凍融移植周期。其中，<35歲組1 887周期，≥35歲組515周期。兩組根據囊胚來源的D3胚胎細胞數各分為3個亞組，分別是4～6細胞、7～9細胞和≥10細胞+融合期。各細胞數亞組對應患者的基本情況和移植結局如表2所示。

表2 不同細胞數D3胚胎來源的囊胚凍融單囊胚移植一般資料及妊娠結局比較[(-±s)，n(%)]

在<35歲組中，7～9細胞亞組的臨床妊娠率和活產率顯著高于4～6細胞亞組(P值分別為0.028、0.041)；≥10細胞+融合期亞組的臨床妊娠率和活產率亦顯著高于4～6細胞亞組(P值分別為0.015、0.022)；7～9細胞亞組的臨床妊娠率和活產率與≥10細胞+融合期亞組相似(P值分別為0.404、0.413)。在≥35歲組中，3個亞組來源的囊胚凍融單囊胚移植妊娠結局無顯著性差異(P>0.05)。<35歲組的臨床妊娠率和活產率顯著高于≥35歲組(P=0.000)。

三、D3不同細胞數對囊胚整倍體率的影響

本研究共納入1 069個行PGT-A的囊胚，其中<35歲組609個，≥35歲組460個。兩組根據D3胚胎細胞數各分為3個亞組，分別是4～6細胞、7～9細胞和≥10細胞+融合期。如表3顯示，在<35歲、≥35歲組兩組內，各細胞數來源的囊胚整倍體率均無統計學差異(P>0.05)；≥35歲組的總體整倍體率顯著低于<35歲組(P=0.000)。

表3 不同細胞數D3胚胎來源的囊胚活檢后整倍體率比較[n(%)]

討 論

影響囊胚發育潛能的因素有很多，例如患者年齡、原核數目、卵裂期胚胎質量及培養體系等[6-10]。女方年齡為公認的影響因素，目前國內外學者對于婦女高齡沒有統一的標準。文獻報道女方年齡≥35歲時，卵母細胞和胚胎非整倍體率增加[11]，而染色體異常是導致IVF植入失敗、流產、胎兒發育異常等的重要因素。大多數文獻支持將婦女年齡在35歲及以上定義為高齡，因此本研究將女方年齡按照<35歲(年輕組)和≥35歲(高齡組)進行分組，研究2PN來源的不同D3細胞數卵裂期胚胎的囊胚培養結局。研究結果顯示高齡組的整倍體率顯著低于年輕組，這在一定程度上解釋了高齡組的臨床妊娠率及活產率低于年輕組。

近幾年關于囊胚形成的研究通常按行囊胚培養的胚胎細胞數進行分組研究[12-13]。有學者發現，囊胚形成率會隨著行囊胚培養的胚胎細胞數目的增加而升高[14]，而11+細胞胚胎在可利用囊胚形成上與8～10細胞胚胎表現出相似的發育潛能[15]。研究還發現發育較快的胚胎與8細胞胚胎有相似的妊娠結局[16]；通過Time-lapse挑選出發育較快的胚胎同樣有較好的妊娠結局[17-18]。本研究結果顯示在年輕、高齡兩組中，8細胞胚胎的囊胚形成率、可利用囊胚形成率以及優質囊胚形成率均最高。在年輕組，融合期胚胎的發育潛能僅次于8細胞胚胎，其囊胚形成率和可利用囊胚形成率顯著高于11+細胞胚胎。11+細胞胚胎的囊胚形成率位居第三，其優質囊胚形成率顯著高于9細胞胚胎。融合期胚胎與11+細胞胚胎都屬于發育比較快的胚胎，本研究結果與前述研究類似。還有學者發現，發育較快的胚胎中約70%染色體異常者在囊胚形成的過程中將會被淘汰，因此形成較高質量的囊胚有更高的發育潛能[19]。而在高齡組中，7～10細胞胚胎以及11+細胞胚胎表現出相近的發育潛能，可利用囊胚形成率無統計學差異。對于發育遲緩的胚胎，本研究結果顯示其囊胚形成率與可利用囊胚率較低，與之前的研究[15]類似，在高齡組中4細胞胚胎要優于5細胞胚胎，6細胞胚胎要明顯優于4細胞胚胎和5細胞胚胎。

通常生殖領域醫生根據卵裂期胚胎的形態學評分系統進行評分，選擇優質胚胎予移植或冷凍。傳統的觀念認為，在卵母細胞受精后D3胚胎應發育到8細胞，生長過慢或過快的胚胎染色體異常的概率增加，所以通常會選擇7～9個細胞的胚胎進行移植或冷凍。但是有研究發現僅以D3胚胎形態預測胚胎發育潛能不夠精確[20]，甚至對公認的D3優質胚胎評分標準提出了質疑。細胞數作為影響評級的關鍵因素，在年輕組中只有Ⅲ級評分的11+細胞胚胎的發育潛能甚至優于Ⅰ、Ⅱ級的7細胞、9細胞胚胎，據此我們也認為目前的細胞評級體系可能不夠精確，有待于完善。在研究不同細胞數D3胚胎來源囊胚的妊娠結局時，在兩個年齡組中根據細胞發育的快慢分了3個亞組。結果顯示，年輕組中整體的臨床妊娠率、活產率及整倍體率均顯著高于高齡組(P<0.05)，這一結果說明年輕組中較高的單囊胚移植臨床妊娠率可能與其較高的整倍體率有關。在年輕組中，4～6細胞胚胎來源的囊胚凍融單囊胚移植的臨床妊娠率和活產率顯著低于其他細胞數胚胎來源者，而各細胞數胚胎來源的囊胚整倍體率無統計學差異。這一結果說明低細胞數胚胎來源的囊胚妊娠結局差的原因可能不是由于整倍體原因，或許是由于其他原因。在高齡組中，各細胞數胚胎來源的囊胚臨床妊娠率、活產率及整倍體率均無統計學差異，這一結果表明，高齡組中凍融單囊胚移植的妊娠結局受D3細胞數影響不明顯，只要有囊胚形成則能保持較滿意的妊娠率。有研究發現，對于高齡患者進行囊胚培養可以篩選出具有較高發育潛能的胚胎，淘汰部分發育潛能較差的胚胎，最終提高活產率[21]。

本研究也存在一些局限性：首先，本研究只納入了D3胚胎的細胞數，而沒有對其他方面進行研究。但有學者發現卵裂期胚胎細胞數比卵裂球均一情況以及胚胎碎片更能預測胚胎的發育潛能，生長速率是有力的指標之一[22-23]。其次，上述的3部分研究中亞組樣本數量差距較大，例如8細胞亞組(及8細胞所在的亞組)數量相對較多，個別亞組數量較少。卵母細胞受精后66～68 h應形成8細胞，8細胞比例較高是胚胎發育的自然規律，只是有的胚胎卵裂相對過快或過慢，但這部分胚胎并不是多數，所以出現個別亞組數量較少。因此，后期需要進一步擴大樣本數量來驗證本研究的結論。

綜上所述，在年輕(<35歲)和高齡(≥35歲)兩個年齡組中，D3卵裂期胚胎細胞數與囊胚形成呈現出不同的發育規律，與傳統的胚胎評分標準出現了一定差異。本研究為臨床上胚胎篩選移植策略提供了以下幾點參考：對于年輕患者在囊胚移植挑選胚胎時，當囊胚評分一致時盡量不選擇D3低細胞數胚胎來源的囊胚；對于高齡患者，只要有囊胚形成其妊娠結局不受D3胚胎細胞數影響；在D3胚胎評分時，可以按照不同年齡進一步細化細胞數，更合理地選擇移植或冷凍的胚胎，為患者提供更佳的個體化治療方案。