供精常規體外受精過程中多精受精的發生對生殖結局的影響

趙小利，薛俠，師娟子，李明昭

(西北婦女兒童醫院生殖中心，西安 710003)

目前，已報道的影響多精受精發生的因素很多，且仍存在爭議。有研究分析了1984—2019年中國有生育力男性精子濃度的變化，數據顯示我國男性精子濃度呈下降趨勢[3]。鑒于男性精液質量的逐年下降，需尋求供精治療的IVF周期越來越多，通常占所有IVF周期的1%～3%[4]。本研究選取供精IVF(IVF-D)治療的患者作為研究對象，以盡可能降低精子因素對多精受精發生的影響，旨在探討多精受精的發生是否影響IVF-D周期其它正常受精胚胎的發育和臨床結局。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2014年1月至2020年12月于我院行IVF-D治療患者的臨床資料。

納入標準：(1)女方年齡≤38歲；(2)女方血清基礎FSH(bFSH)<10 U/L；(3)第1次新鮮周期供精常規IVF-ET。排除標準：(1)子宮內膜異位癥；(2)卵巢功能衰退；(3)子宮畸形及宮腔病變；(4)輸卵管積水；(5)多囊卵巢綜合征。

共納入1 526例患者。根據多精受精(≥3PN)率不同分為3組：多精受精率為0%的為對照組(n=854)，0%<多精受精率≤20%的為低頻多精組(n=483)，多精受精率>20%的為高頻多精組(n=189)。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COH)：所有患者均采用COH，根據患者具體情況選擇合適的COH方案，具體細節參考已報道文獻[5]。

2.精液處理及常規授精：將精液凍存管放入37℃水浴10 min，精液復蘇后精子活動率>40%，采用密度梯度離心法與上游法相結合的方法獲得活動精子。具體操作流程如下：密度梯度離心采用40%及80%上下層梯度離心液(Cooper Surgical，美國)，洗滌液和上游液分別為精子洗滌液(Spermrinse，Vitrolife，瑞典)和受精液(G-IVF plus，Vitrolife，瑞典)。采用四孔板進行授精，每孔加入0.6 ml預平衡好的受精液，通過精子計數每孔加入1.0×105條精子，每孔放置2～3枚卵母細胞，精卵共同孵育，5 h后將卵母細胞轉移至無精子的受精液中去除顆粒細胞。

3.受精觀察：受精5 h后脫顆粒觀察第二極體，如果1/3的成熟卵可見明顯第二極體，直接放回培養箱繼續培養，18 h后再次觀察，有2個原核(2PN)判定為正常受精，3個及以上者(≥3PN)判定為多精受精。

4.胚胎培養及移植策略：受精卵繼續培養48 h后觀察胚胎發育情況，選擇第3天(D3)卵裂期胚胎移植，或培養至D5進行囊胚移植。根據D3胚胎質量評級，對于有≥2個以上優質卵裂胚的患者在充分知情同意后繼續行囊胚培養至D5，有優質囊胚者行單囊胚移植，無優質囊胚者行雙囊胚移植。胚胎評分標準參考已報道的評分方法[6]。

為研究表活劑擴散彌散對開發效果的影響，保證模型中其他參數設置不變，通過改變表面活性劑濃度來改變毛細管力，使其分別原始毛細管力的0.5倍、0.66倍、1倍、1.5倍、2倍，對比不同聚合物吸附濃度的開發效果，模擬結果見表3。

5.妊娠判斷：移植后6周B超見孕囊者為臨床妊娠，移植后12周B超見胎心者為持續妊娠。妊娠不足28周、胎兒體重小于1 kg而終止妊娠者為流產。胎兒出生后具有呼吸、心跳、臍帶搏動、隨意肌收縮4種生命現象之一者為活產。

6.觀察指標：主要觀察指標為正常受精率、卵裂率、優胚率、可用胚胎率、囊胚形成率、種植率、臨床妊娠率、多胎率、流產率、異位妊娠率、持續妊娠率及活產率。正常受精率=正常受精卵母細胞數/獲卵總數×100%，卵裂率=受精卵裂胚胎數/受精卵數×100%，優胚率=優質胚胎數/正常受精卵裂胚胎數×100%，可用胚胎率=可用胚胎數/正常受精卵裂胚胎數×100%，囊胚形成率=形成囊胚數/行囊胚培養的胚胎數×100%，種植率=著床胚胎數/移植胚胎數×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%，多胎率=多胎妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%，流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%，異位妊娠率=發生異位妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%，持續妊娠率=持續妊娠周期數/移植周期數×100%，活產率=活產嬰兒周期數/移植周期數×100%。

三、統計學分析

結 果

一、各組基本資料比較

本研究共納入1 526例患者，共1 526個IVF-D周期，其中多精受精率0%的占比為55.96%(854/1 526)，0%<多精受精率≤20%的占比為31.65%(483/1 526)，多精受精率>20%的占比為12.39%(189/1 526)。

各組間年齡、體質量指數(BMI)、不孕年限、bFSH及促性腺激素(Gn)天數比較均無顯著性差異(P>0.05)；對照組的獲卵數顯著低于低頻多精組[(9.51±4.43)枚vs.(12.39±3.86)枚，P<0.05](表1)。

表1 各組間患者基本資料比較(-±s)

二、各組胚胎發育情況比較

與高頻多精組比較，對照組和低頻多精組的正常受精率顯著升高(P<0.05)，而可用胚胎率顯著降低(P<0.05)；各組間卵裂率、優胚率及囊胚形成率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組間胚胎發育情況比較(%)

三、各組胚胎移植情況及妊娠結局比較

各組間移植日內膜厚度、移植胚胎數、單胚胎移植率和囊胚移植率比較均無顯著性差異(P>0.05)；對照組和低頻多精組的種植率、臨床妊娠率、多胎率、持續妊娠率及活產率均略高于高頻多精組，流產率和異位妊娠率略低于高頻多精組，但差異均無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 各組間胚胎移植情況及妊娠結局比較[(-±s)，%]

討 論

精卵受精的過程受到多重機制的調控，透明帶反應和皮質反應這兩個重要機制確保了正常受精的發生。透明帶反應是阻止多精受精發生的首要機制，透明帶硬化阻止正在穿透透明帶的精子繼續進入卵母細胞；皮質反應是阻止多精受精發生的另一重要機制，卵母細胞釋放皮質顆粒，切割透明帶中的精子結合位點，導致其他精子不能識別進而與卵母細胞結合。近些年，又有一些新的多精受精防護機制相繼被報道。有研究發現，受精后卵母細胞質膜上的部分精子受體蛋白迅速消失，使得其它精子不再與質膜發生融合[7]。谷氨酰胺轉胺酶2(Tgm2)在卵母細胞的皮層下大量積累，并于受精后發揮功能，已有研究證實Tgm2是一個新的阻止多精受精發生的分子[8]。

常規IVF過程中，多精受精的發生率仍有2%～10%[9]。導致多精受精發生的因素可能來自精子因素，也可能來自其它因素。早期有研究認為，精子濃度增加可能導致卵母細胞皮質顆粒延遲釋放提高多精受精率[10]。但也有研究認為，精子濃度增加不會提高多精受精率[11]。眾所周知，未成熟卵母細胞不能發生完善的皮質反應和透明帶反應，導致多精受精率增加。過熟卵母細胞老化后，只能部分釋放或不能釋放皮質顆粒，致使皮質反應不徹底或不能發生皮質反應，也會導致多精受精率增加。有研究發現，HCG日E2水平高和獲卵數多是導致多精受精發生的重要因素，低頻多精組的平均獲卵數顯著高于對照組[12]。本中心研究數據亦顯示，低頻多精組的平均獲卵數顯著高于對照組(P<0.05)。獲卵數多可能導致部分卵母細胞發育程度參差不齊，出現未熟和過熟卵母細胞幾率增加，進而導致多精受精現象的發生。本中心采用短時受精和早剝離顆粒細胞的技術手段，目前關于此類操作是否影響多精受精的發生仍存在爭議[13-14]。有研究發現，短時受精和早剝離顆粒細胞較過夜受精不會提高多精受精率[15]。

關于多精受精的發生是否影響IVF-ET患者的臨床結局一直存在爭議。有研究發現，多精受精出現的周期臨床妊娠率高于無多精受精出現的周期[16-17]。也有研究認為，多精受精的發生不會降低IVF-ET患者的臨床妊娠率，但是過高的多精受精率可能會降低臨床妊娠率[18]。

精子作為一種高分化細胞，早先的研究一直認為精子通過受精只傳遞了基因組DNA，并未攜帶有任何參與蛋白質合成的RNA，早期胚胎的發育主要受卵母細胞質量影響[19]。但近些年有學者發現，精子通過受精向卵母細胞傳遞了精子中的RNAs，證實精子質量是影響IVF-ET胚胎質量和臨床結局的重要因素[20-21]。本研究選取IVF-D周期作為研究對象，盡可能降低精子因素對胚胎發育和臨床結局的影響。

本研究結果表明，對照組和低頻多精組的正常受精率(2PN率)相似，且均顯著高于高頻多精組(P<0.05)。多精受精的發生，提示精子獲能良好，同時反應卵母細胞具備良好的接受精子的能力。本研究的低頻多精組通常包括1～2枚多精受精合子，數量有限，可能不會對2PN率造成不利影響。然而，高頻多精組由于多精受精合子數量較多，部分患者甚至僅有1～2枚正常受精合子，其余均為多精受精合子，大量多精受精合子的出現降低了2PN率。本研究發現，各組間卵裂率、優胚率及囊胚形成率比較均無顯著性差異(P>0.05)，表明多精受精的發生不影響早期胚胎的發育。本研究結果表明，多精受精組患者通常有著理想的獲卵數，獲卵數佳表明患者對促排卵方案反應好，多精受精合子的出現可能與卵母細胞的過熟或未熟相關，而其它卵母細胞處于理想的成熟狀態，可以形成優胚，并成功發育成囊胚。

對照組和低頻多精組的種植率、臨床妊娠率、持續妊娠率及活產率均略高于高頻多精組，流產率略低于高頻多精組，但差異無統計學意義(P>0.05)。納入本研究的周期均為第1次新鮮胚胎移植周期，各組患者的優胚率相似，且均在50%以上。因此，高頻多精組較低的臨床妊娠率、持續妊娠率及活產率可能與胚胎質量無關。為了進一步分析原因，我們比較了各組患者的單胚胎移植率和囊胚移植率，我們發現各組間單胚胎移植率相似，高頻多精組的囊胚移植率略高于對照組和低頻多精組，但差異無統計學意義(P>0.05)。胚胎基因組通常在8細胞時期開始激活，大量研究表明，囊胚移植較卵裂期胚胎移植可以獲得更為理想的臨床結局[22-23]。高頻多精組的囊胚移植率較高，而囊胚移植率的提升并未改善臨床結局，活產率反而較其它兩組有所下降。本中心早期針對卵裂期胚胎移植患者，通常建議移植兩枚胚胎。若是囊胚移植，且有優質囊胚，通常建議選擇單囊胚移植。高頻多精組囊胚移植成功率略有降低，可能與非整倍體囊胚移植比例升高相關。有研究通過延時攝像系統(Time-lapse)對高頻多精受精周期中正常受精胚胎進行觀察發現，兩例多PN合子≥5枚且僅有1枚2PN合子的常規IVF受精周期中，唯一的2PN合子均出現了兩細胞多核現象[24]。高頻多精組囊胚移植活產率的下降可能是卵裂球多核來源的囊胚移植比率升高所致。

綜上，IVF-D周期多精受精的發生，通常提示我們此類患者卵母細胞胞質和核的成熟情況可能異常，這對助孕治療中促排卵和授精方案的制定有一定的提示作用。本研究認為IVF-D周期高頻多精受精的發生不影響胚胎的發育，但可能會降低活產率。由于本研究納入樣本數有限，可能造成結果的片面性，今后還需進一步積累數據，深入探討以得到更具說服力的結論。