傳統針刺療法對波塞冬第三分組POR患者IVF-ET輔助治療效果及細胞因子的影響：隨機對照研究

楊婷，茍文婕，王薇，趙翠，陳學良，馬曉玲，王雅琦，張學紅

(蘭州大學第一醫院生殖醫學中心，甘肅省生殖醫學與胚胎重點實驗室，蘭州 730000)

隨著輔助生殖技術的發展，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術能夠解決大多數不孕癥患者的生育問題，然而仍有20%的不孕癥患者在IVF-ET治療中表現出對促性腺激素(Gn)刺激反應不良，獲卵數少、優質胚胎率及臨床妊娠率低，被稱為卵巢低反應(POR)[1]。近年來，文獻報道POR患者的發病率呈現逐年上升且年輕化的趨勢，其IVF-ET臨床妊娠率僅為11.5%，周期取消率為34.4%[2]。如何提高POR患者輔助生殖助孕活產率，解決生育力低下問題，逐漸受到生殖醫學界的廣泛關注。

傳統針刺療法是一種安全綠色療法，在輔助生殖領域應用廣泛，目前關于其提高IVF-ET臨床妊娠率的作用尚存在爭議[2]。本課題采用波塞冬POR分類標準，選取滿足第3分組標準[3]的患者，即年齡<35歲、抗苗勒管激素(AMH)<1.2 ng/ml、基礎竇卵泡計數(AFC)<5個。目的在于綜合考量POR患者的年齡、卵巢儲備及反應性，減少研究中的人群異質性，規避年齡對活產率的直接影響，期望更精確探究傳統針刺治療對POR患者卵子質量、妊娠結局及卵泡液中相關因子的表達，以及對于顆粒細胞線粒體DNA(mtDNA)拷貝數的影響。

資料與方法

一、研究對象及分組

選取2017年10月至2020年10月年因不孕癥在蘭州大學第一醫院生殖中心行IVF-ET治療的POR患者為研究對象。

納入標準：年齡<35歲；符合POR波塞冬標準第3分組診斷標準[3]；因女性輸卵管因素行輔助生殖治療患者；促排卵方案采用改良微刺激方案。

排除標準：因放、化療或藥物使用等引起的POR；處于嚴重內科疾病急性期；近期(3個月內)服用中藥、使用理療或者艾灸者；合并嚴重子宮畸形、宮腔粘連、腺肌癥、子宮內膜異位癥者；合并男性因素不孕者；夫婦因染色體異常行胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)助孕者；改良微刺激方案當月移植者。

根據臨床試驗最低樣本量30例，考慮允許脫落率為20%，通過SPSS 20.0計算樣本總病例數為109例。采用隨機數字表法進行分組，由SPSS 20.0軟件自動生成隨機數字，將不同的數字卡片放在紙袋中密封。根據患者就診順序，隨機抽取信封，其中抽取的數字卡片為單數者納入針刺治療組(針刺組)共50人，抽取的數字卡片為雙數者納入空白對照組(對照組)共59人。

剔除標準：受試者依從性差，不能堅持研究治療方案者；治療中出現嚴重不良反應及嚴重并發癥，或促排卵過程中因低反應取消取卵者；因其他原因自行要求退出者。

本研究方案經蘭州大學第一醫院倫理委員會批準(審批號：LDYYLL2020-164)，所有研究對象均充分知情同意后簽署知情同意書。

二、治療方案

1.針刺治療：采用房繄恭教授的“房氏調經促孕十三針”方案，選取關元、大赫(雙)、氣海、腎俞(雙)、中極、足三里(雙)、三陰交(雙)、太沖(雙)、太溪(雙)穴[4]。具體實施中，關元、大赫(雙)、氣海、腎俞(雙)、足三里(雙)各穴直刺1～1.5寸；中極、三陰交(雙)、太沖(雙)、太溪(雙)各穴直刺0.5～1寸。腧穴要求得氣，留針期間每隔10 min平補平瀉法行針1次，共留針30 min。于促排卵前連續2個月于患者早卵泡期開始每日針刺1次，共10 d；促排卵期間從促排卵第1天開始針刺10 d，共計3個周期。針刺治療由同一位副主任針灸醫師獨立完成。對照組不進行針刺治療。

2.IVF-ET治療：患者均采用改良微刺激促排卵方案。在月經第2天予來曲唑(江蘇恒瑞醫藥)2.5 mg/d共5 d，同時給予尿促性腺激素(HMG，珠海麗珠醫藥)150～300 U/d，根據卵泡生長情況及激素水平適時調整藥物用量。當主導卵泡直徑大于18 mm時扳機，注射重組HCG(默克雪蘭諾，德國)250 μg，34～36 h后取卵，常規行IVF。獲得優質胚胎冷凍保存，擇期行凍融胚胎移植(FET)。

3.FET：FET周期均采用人工周期方案準備內膜。患者月經周期第3～5天予戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)4～6 mg/d共14～18 d，經陰道超聲監測內膜厚度≥8 mm時予口服地屈孕酮(雅培，荷蘭)30 mg/d和陰道放置黃體酮軟膠囊(益普生，法國)600 mg/d行黃體轉化3 d，選擇凍融復蘇的優質卵裂期胚胎進行移植，移植術后持續黃體支持至驗孕日。

4.妊娠判定：移植后兩周檢測血HCG陽性(HCG≥5 U/L)但B超未見孕囊者為生化妊娠；移植后4周陰道超聲觀察到宮內妊娠囊及胎心搏動為臨床妊娠；患者孕28周以上胎兒出生有生命跡象為活產。

三、實驗操作

1.卵泡液及顆粒細胞收集：患者取卵術后，保留直徑≥18 mm成熟卵泡的清亮卵泡液，常溫下2 000 r/min離心，取上清液-80℃冰箱保存待檢；取沉淀置于2 ml 50% Percoll液中，4 000 r/min離心10 min，去除血細胞，吸出兩層界面處的顆粒細胞，重復加入2 ml 50% Percoll液，吸出漂浮絮狀顆粒細胞，PBS清洗2次，-80℃冰箱保存待測。

2.卵泡液細胞因子檢測：酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒(上海恒遠生物)測量卵泡液β-內啡肽(β-EP)、間隙連接蛋白43(Cx43)、骨形態發生蛋白-4(BMP-4)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、環氧合酶-2(COX-2)水平。實驗采用雙抗體夾心法酶聯免疫分析，用特異性抗體包被于固相載體，經過洗滌之后再加入待測樣品(含抗原)，經過保溫孵育洗滌等一系列操作后，進行顯色之后測定，測定出欲測抗原(底物)的量。

3.顆粒細胞DNA提取及mtDNA拷貝數定量檢測：采用柱式法DNA抽提試劑盒(上海生工)抽提DNA，通過實時定量PCR(Real time-PCR)方法，選取高度保守序列ND1(mtDNA管家基因)作為目的基因，HGB基因作為內參，通過相對定量方法計算mtDNA拷貝數。ND1基因引物：上游5′-CCCTAAAACCCGCCACATCT-3′，下游5′-GAGCGATGGTGAGAGCTAAGGT-3′；HGB基因引物：上游5′-GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3′，下游5′-CCTTGATACCAACCTGCCCAG-3′。MT-ND1擴增條件是：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，40個循環；HGB的擴增條件是：95℃ 10 min，95℃ 15 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，40個循環。采用實時定量PCR分別得到兩組的顆粒細胞中目的基因ND1和HGB的CT值，通過2-ΔΔCT的計算方法得到相對表達量。

四、觀察指標

研究對象的一般資料，包括年齡、不孕年限、體質量指數(BMI)、AFC、AMH水平；促排卵指標，包括促排卵天數、促排卵用藥總量、獲卵數、卵泡輸出率[HCG日成熟卵泡數(直徑16～22 mm卵泡)/基礎竇卵泡數(直徑3～8 mm卵泡)×100%]、MⅡ卵率(MⅡ卵母細胞數/總獲卵數×100%)；受精及胚胎培養/移植結局，包括2PN數、2PN受精率(2PN數/MⅡ卵母細胞總數×100%)、優質胚胎率(優質胚胎數/2PN數×100%)及累計活產率(獲得活產的患者數/一次取卵周期患者數×100%)等。

五、統計學方法

結 果

一、患者助孕資料

本研究共納入109例POR波塞冬第3分組患者，隨機分為針刺組(50人)和對照組(59人)兩組。兩組患者均無中途脫落，無失訪病例，無不良反應發生病例。

1.患者基礎資料：兩組患者間年齡、不孕年限、BMI、AMH、AFC比較均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者基礎資料比較(-±s)

2.患者助孕過程及結局資料：針刺組MⅡ卵率顯著高于對照組(P<0.05)；兩組患者間其他促排卵、胚胎發育指標比較均無統計學差異(P>0.05)；兩組間解凍移植日內膜厚度及累計活產率比較均無統計學差異(P>0.05)(表2)。

二、卵泡液中卵子發育相關因子和炎癥因子表達

針刺組患者卵泡液中ICAM-1及COX-2濃度均顯著低于對照組(P<0.05)，而兩組間卵泡液中β-EP、Cx43、BMP-4濃度比較均無統計學差異(P>0.05)(表3)。

表2 兩組患者助孕過程及結局資料比較[(-±s)，%]

表3 兩組患者卵泡液細胞因子濃度比較(-±s)

三、顆粒細胞mtDNA拷貝數

本研究采用實時定量PCR分別得到兩組患者顆粒細胞中mtDNA管家基因ND1和HGB的CT值，通過2-ΔΔCT計算相對表達量。經t檢驗，針刺組和對照組ND1和HGB的相對表達量差異無統計學意義(P=0.835)，提示兩組間線粒體基因拷貝數無統計學差異(P>0.05)(表4)。

表4 兩組患者顆粒細胞mtDNA拷貝數比較(-±s)

四、安全性評價

針刺組與對照組患者治療前后檢測血、尿常規及肝腎功能和心電圖均未見明顯異常，均未出現卵巢過度刺激綜合征(OHSS)及取卵后出血等不良事件。

討 論

目前POR患者發病率逐年上升且年輕化，該類患者IVF-ET妊娠率仍不理想。文獻報道給予POR患者300 U促性腺激素(Gn)啟動劑量，IVF促排卵周期活產率僅為11%[5]。有研究表明導致POR的危險因素包括年齡、遺傳、免疫、環境、卵巢手術、放化療等[6]，提高POR患者IVF-ET臨床妊娠率的關鍵靶點在于提高IVF-ET治療中的卵泡輸出率及胚胎質量，以下措施目前較為常用：優化促排卵方案，添加生長激素、脫氫表雄酮(DHEA)、抗氧化劑等，卵母細胞線粒體移植技術，傳統中藥及針灸療法等[7]。本研究旨在探討傳統針刺治療對于POR患者IVF-ET治療中胚胎質量及卵泡發育相關因子表達的影響。

一、傳統針刺治療對IVF累計妊娠率及活產率的影響

近年來國內外發表的多項臨床試驗及系統評價對于針刺療法是否能改善IVF妊娠結局尚存在爭議。多項研究表明針刺治療可以提高IVF-ET患者的臨床妊娠率[8-9]；而2017年美國生殖醫學會(ASRM)指南中指出輔助針刺治療不能改善妊娠結局[10]；Smith等[11]研究顯示，針刺不能提高接受IVF-ET治療患者的活產率，但國內王亞楠等[12]指出Smith等[11]的研究所選取的患者群體、針刺選穴、刺激量及介入時機，以及患者自身狀況不同造成研究結果異質性大。另有研究表明，在IVF-ET治療中輔助傳統針刺及激光針刺療法能夠緩解患者緊張，改善患者心理壓力等情緒問題[13]。

本研究中針刺組與對照組患者累計活產率無統計學差異(P>0.05)，分析原因可能與選取人群有關。有研究表明年齡是預測圍產期結局和累計活產率的關鍵參數[8]，本研究中選取波塞冬第3分組的POR患者，年齡<35歲，排除子宮畸形及男方因素性不孕，前期均募集到優質胚胎，所以兩組累計活產率均能達到50%左右。本研究中傳統針刺治療3個周期并不能提高波塞冬第3分組POR患者的累計活產率，但因本研究樣本量較少，針刺治療是否能提高IVF-ET患者的累計活產率仍需要多中心、同質化的大樣本臨床研究來驗證。

二、傳統針刺治療對POR患者的作用

本研究結果表明針刺組較對照組POR患者MⅡ卵率顯著提高(P<0.05)。Haahr等[7]指出，針對波塞冬第3分組的年輕POR人群，IVF-ET的困難在于如何提高卵泡輸出率和募集優質胚胎。李曉彤等[14]指出針刺對于卵巢儲備功能低下(DOR)的患者有一定的治療作用，其研究發現針刺調經促孕治療可以改善DOR患者的卵巢儲備功能，且安全性較好。本研究中兩組POR患者獲卵數無統計學差異(P>0.05)，卵泡輸出率均達到80%以上，受精率及優質胚胎率無統計學差異(P>0.05)，但針刺組MⅡ卵率顯著提高(P<0.05)，平均優質胚胎數略高于對照組，雖無統計學差異，但對于AFC<5個的POR患者來說，多1個可用優質胚胎可相對增加POR患者移植機會。

三、傳統針刺輔助治療后卵泡液細胞因子指標變化

在本研究中，兩組患者卵泡液中β-EP、Cx43、BMP-4表達無統計學差異(P>0.05)。卵泡液為卵母細胞的發育提供了非常重要的微環境，卵泡液相關生化指標可以反映卵子成熟度及后期胚胎發育潛能[15]。Tam等[16]發現β-EP水平在IVF患者獲得形態成熟卵母細胞的卵泡液中較未成熟卵母細胞卵泡液中含量低，認為卵巢局部分泌β-EP，卵泡液中少量的β-EP與卵母細胞發育潛能有關。本研究中針刺組與對照組卵泡液β-EP濃度未見明顯差異，提示針刺治療可能并不影響卵巢局部分泌β-EP。BMP-4為轉移生長因子-β(TGF-β)超家族一員，是卵泡生長發育過程中的促進因子，參與卵巢內調節系統，其能促進始基卵泡向竇前卵泡轉化和生長[17]。Cx43表達于顆粒細胞與卵母細胞之間，進行新陳代謝物質傳遞及雙向信息交流，在卵泡選擇過程中發揮重要作用[18]。本研究中兩組患者卵泡液中Cx43、BMP-4表達均無明顯差異，由此我們推測傳統針刺治療在卵泡早期募集階段可能發揮作用不大。

本研究中，針刺組患者卵泡液中ICAM-1、COX-2水平較對照組顯著降低(P<0.05)。ICAM-1被稱為CD54，在白細胞和內皮細胞中少量表達，在白介素-1(IL-1)等作用下在多種類型的細胞中表達上調，參與調節炎癥反應和免疫應答[19]。COX-2是一種環氧酶同工酶；細胞受到刺激后，經過一系列信號轉導促進其表達，催化前列腺素合成，參與炎癥反應[20]。有研究表明在卵巢干細胞體外培養實驗中，炎性因子可能干擾其正常功能并引起卵巢干細胞凋亡[21]。本研究中針刺治療能夠降低卵泡液中ICAM-1、COX-2分泌水平，一定程度上抑制了IVF-ET促排卵治療中的過度炎癥反應，對于卵子發育具有正性作用。

四、傳統針刺輔助治療后顆粒細胞mtDNA表達變化

顆粒細胞是組成卵冠丘復合物的主要細胞成分，為卵母細胞提供ATP合成底物、相關類固醇激素及生長因子，保護卵母細胞免受氧化應激損傷[22]。顆粒細胞mtDNA拷貝數可以直接反應線粒體生物學功能，與胚胎質量密切相關。有研究表明優質胚胎較劣質胚胎mtDNA拷貝數明顯增高[23]。本研究中，兩組患者間顆粒細胞mtDNA拷貝數無統計學差異(P>0.05)，針刺組略有增高的趨勢，這與針刺組的優質胚胎數略高于對照組的趨勢一致，但考慮到本研究樣本量有限，后續還需要大樣本研究進行進一步的探討。

五、POR患者輔助傳統針刺治療的中醫辨證學分析

中醫學認為腎主生殖，司開合，為生殖之本。POR不孕癥患者歸屬為“不孕”“閉經”“血枯”等范疇，發病大多與肝郁脾虛、腎精不固、天癸、沖任和子宮功能失調，臟腑氣血虧虛，沖任不能相資，影響胞脈胞絡的功能[4]。

POR患者在促排卵階段表現為腎陽匱虛、脾失健運，肝氣郁滯、氣滯血瘀，氣血失衡[14]。中國中醫科學院針灸醫院房繄恭教授根據患者發病特點，選取疏肝解郁、滋補脾腎、調理沖任氣血的穴位，配合恰當的補瀉手法形成“房式十三針”方案[4]。本研究遵循“房式十三針”經典選穴方案，主要選穴任沖二脈，足三陰經及膀胱經的穴位；常用腧穴是以任脈的中極、關元、氣海，針之可固腎益精、調節沖任；胃經的足三里，針之可健脾和胃、扶助正氣；脾經的三陰交，針之可健脾益腎、通絡調經、補血活血；膀胱經的腎俞，針之可有效刺激盆腔神經，影響盆腔內生殖活動；腎經的大赫，肝經的太沖等為常用首選要穴。以上諸穴相互配伍，攻補兼施。

綜上，在輔助生殖治療中輔助針刺治療由來已久，針刺療法做為一種安全綠色的補充治療方法，具有多層次、多水平、多靶點的綜合治療作用。本研究發現，波塞冬POR第3分組患者IVF-ET治療中輔助3個周期傳統針刺治療能夠提高MⅡ卵率，降低卵泡液中炎性因子ICAM-1、COX-2的分泌，但對于妊娠結局的影響不大。提示傳統針刺療法可能通過降低卵泡液中炎性因子水平發揮改善卵子質量的作用，但需要更進一步的研究加以驗證。