IVF/ICSI-ET實驗室因素對子代出生性別比的影響

勞艷萍，姚妮，唐秀法，公方強，黃華，牛向麗

(廣西壯族自治區生殖醫院，南寧 530000)

出生性別比(Sex ratio at birth，SRB)的平衡對于維持社會穩定、促進經濟發展具有重要意義，性別比例的嚴重失衡可能引發一系列社會問題。SRB以每出生100個女嬰對應出生男嬰數表示。第一性別比(Primary sex ratio，PSR)是指懷孕時的男女性別比例。有數據表明，自然妊娠的PSR為107～170∶100[1]，其會因為自然流產或性別選擇等因素顯著降低。SRB是監測人口生殖健康簡單又無創的一種方式[2]。傳統的自然妊娠男女嬰兒的出生比例為106～110.2∶100[3]。我國不孕不育發病率呈逐年上升的趨勢，2007年我國的不孕率約為12%，2010年不孕率上升至15%，2020年不孕率上升至18%左右。輔助生殖技術(ART)幫助很多不孕癥患者實現成功受孕，我國每年ART總周期數在100萬以上，出生嬰兒數超過30萬[4]。隨著大量試管嬰兒的出生，會不會影響SRB？引起性別比例失衡？以上這些問題都有待驗證。因此，本研究回顧性分析2010年1月至2019年12月在我院行體外受精/卵胞漿內單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治療并成功妊娠分娩共19 844個周期患者的臨床資料，排除由患者個人因素如年齡、男方體質量指數(BMI)、女方BMI、不孕類型、職業等因素造成SRB改變的干擾因素，單純從實驗室因素(受精方式、移植胚胎類型、移植胚胎時期和移植胚胎數)分析ART對子代SRB的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2010年1月至2019年12月在我院行IVF/ICSI-ET并成功妊娠分娩的共19 844個周期患者的臨床資料。

納入標準：在電子病例系統中明確含有受精方式、移植胚胎類型、移植胚胎時期和移植胚胎數信息；移植<3枚胚胎；獲得成功妊娠并分娩。

排除標準：受精方式、移植胚胎類型、移植胚胎時期和移植胚胎數其中任一項信息不明確。

二、研究方法

1.分組：由于受精方式、移植胚胎類型、移植胚胎時期和移植胚胎數目等是ART的主要實驗室因素，因此，根據不同受精方式分為IVF組(n=14 626)和ICSI組(n=4 908)(剔除行補救ICSI的310個周期)；根據不同移植胚胎時期分為卵裂胚組(n=8 778)和囊胚組(n=11 066)；根據不同移植胚胎類型分為新鮮胚胎組(n=11 533)和解凍胚胎組(n=8 311)；根據不同移植胚胎個數分為單胚胎組(移植1枚胚胎，n=3 871)和雙胚胎組(移植兩枚胚胎，n=14 483)(剔除移植≥3枚胚胎的1 490個周期)。

2.促排卵方案：依據患者情況采用長方案、短方案、超長方案、微刺激方案、拮抗劑方案、自然周期等促排卵方案，均按照常規操作進行[5]。

3.胚胎冷凍和解凍復蘇：行胚胎冷凍者采用玻璃化冷凍及解凍復蘇[6]；使用玻璃化冷凍解凍試劑盒(KITAZATO，加藤，日本)，早上解凍，當天中午或者下午移植。

4.胚胎質量評價：D3胚胎移植一般選擇優質胚胎，如無優質胚胎，則在患者知情同意的情況下選擇非優質胚胎移植。采用Peter評分法[7]對卵裂期胚胎進行評分；正常受精胚胎中評1～2級、6細胞及6細胞以上的胚胎和提前進入融合期的胚胎為優質胚胎。囊胚評級采用Gardner評分法[8]，根據囊胚腔大小和是否孵出分為1～6期，根據內細胞團和滋養層細胞數目分為A、B、C三級；優先移植3期及以上非CC級囊胚，若無3期及以上囊胚，可移植1、2期囊胚。

5. 胚胎移植：<35歲患者第1次移植周期移植2枚卵裂期胚胎或1枚囊胚，若無優質囊胚形成可移植2枚囊胚；如第1次移植未孕，再次移植時可移植2枚胚胎。≥35歲患者可移植2枚胚胎。患者有剖宮產史或子宮肌壁間肌瘤剔除術后且年齡<40歲，第1、2次移植建議移植1枚胚胎，若無優質胚胎則告知多胎妊娠風險并簽字后可移植2枚胚胎；移植2次優胚均未孕時，告知多胎妊娠風險并簽字后可移植2枚胚胎；年齡≥40歲患者，告知多胎妊娠風險并簽字后可移植2枚胚胎。

三、統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行統計學分析。計數資料用率(%)表示，組間比較采用卡方檢驗；采用單因素以及多因素Logistic回歸分析各因素與SRB的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、IVF/ICSI-ET總體新生兒的SRB情況

我院2010年1月至2019年12月行IVF/ICSI-ET出生的新生兒共24 661名，其中男嬰占54.9%(13 532/24 661)，女嬰占45.1%(11 129/24 661)，該時期ART的SRB(121.6∶100)高于文獻報道的自然受孕的SRB(106～110.2∶100)。新鮮胚胎移植出生的男嬰為7 941名，女嬰6 655名，新鮮胚胎移植出生的新生兒占ART出生總新生兒的59.2%(14 596/24 661)；解凍胚胎移植出生的男嬰5 591名，女嬰4 474名，解凍胚胎移植出生的嬰兒占比為40.8%(10 065/24 661)。除去補救ICSI出生的嬰兒，行IVF出生的男嬰為10 172名，女嬰為8 059名，行IVF出生的新生兒占比為73.9%(18 231/24 661)；行ICSI出生的男嬰為3 135名，女嬰為2 915名，行ICSI出生的新生兒占比為24.5%(6 050/24 661)。移植卵裂胚出生的男嬰為5 829名，女嬰為5 168名，移植卵裂胚出生的新生兒占比為44.6%(10 997/24 661)；移植囊胚出生的男嬰為7 703名，女嬰為5 961名，移植囊胚出生的新生兒占比為55.4%(13 664/24 661)。單胚胎移植出生的男嬰為2 229名，女嬰為1 715名，單胚胎移植出生的新生兒占比為16.0%(3 944/24 661)；雙胚胎移植出生的男嬰為10 264名，女嬰為8 519名，雙胚胎移植出生的新生兒占比為76.2%(18 783/24 661)。

二、IVF/ICSI-ET中不同實驗室因素對SRB的影響

IVF/ICSI-ET的實驗室因素包括：受精方式、移植胚胎類型、移植胚胎時期和移植胚胎數。

1.受精方式對SRB的影響：根據不同受精方式分為IVF組(n=14 626)和ICSI組(n=4 908)。IVF組共出生10 172名男嬰，8 059名女嬰，SRB為126.2∶100；ICSI組共出生3 135名男嬰，2 915名女嬰，SRB為107.5∶100；IVF組SRB顯著高于ICSI組(P<0.05)。對這兩組患者根據移植胚胎時期和胚胎類型進行亞組分層，在相同移植時期或相同胚胎類型的分層中，IVF組SRB均顯著高于ICSI組(P<0.05)(表1)。

表1 不同受精方式對SRB的影響(%)

2.移植胚胎時期對SRB的影響：根據不同移植胚胎時期分為卵裂胚組(n=8 778)和囊胚組(n=11 066)。卵裂胚組的SRB(112.8∶100)顯著低于囊胚組(129.2∶100)(P<0.05)。對這兩組患者根據不同受精方式和胚胎類型進行亞組分層，在相同受精方式或胚胎類型的分層中，囊胚組的SRB均顯著高于卵裂期組(P<0.05)(表2)。

表2 不同移植胚胎時期對SRB的影響(%)

3.移植胚胎類型對SRB的影響：根據不同移植胚胎類型分為新鮮胚胎組(n=11 533)和解凍胚胎組(n=8 311)。新鮮胚胎組的SRB為119.3∶100，解凍胚胎組的SRB為125.0∶100，解凍胚胎組的SRB略高于新鮮胚胎組，但差異尚無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 不同移植胚胎類型對SRB的影響(%)

4.移植胚胎數對SRB的影響：根據不同移植胚胎數分為單胚胎組(n=3 871)和雙胚胎組(n=14 483)。單胚胎組的SRB(130.0∶100)顯著高于雙胚胎組(120.5∶100)(P<0.05)；但是，根據不同移植時期進行亞組分層比較時，兩組間SRB未表現出顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 不同移植胚胎數對SRB的影響(%)

三、單因素和多因素Logistic回歸分析不同影響因素和SRB的相關性

單因素和多因素Logistic回歸分析發現，受精方式[OR=0.854，95%CI(0.803，0.908)]和移植胚胎時期[OR=1.192，95%CI(1.114，1.276)]是SRB的獨立影響因素(P<0.001)(表5)。

表5 單因素和多因素Logistic回歸分析不同影響因素與SRB的相關性

四、2010～2019年我院總SRB變化趨勢

2010～2019年我院IVF/ICSI-ET周期出生新生兒的總SRB變化趨勢如下：SRB沒有明顯逐年升高或者降低的趨勢；在相同年份中，卵裂胚的SRB相對于囊胚有降低的趨勢，ICSI的SRB相對于IVF有降低的趨勢(表6)。

表6 2010～2019年我院總SRB變化趨勢

討 論

從全國人口第7次普查數據得知，男性人口為72 334萬人，占51.24%(72 334/141 178)；女性人口68 844萬人，占48.76%(68 844/141 178)，全國總人口性別比為105.07∶100[9]。性別比偏高的直接原因就是SRB偏高，受到曾經重男輕女思想的影響，SRB曾一路攀高，2000年曾經達到118.6∶100，2010年也停留在118.1∶100，個別省份個別年份的性別比甚至高達125∶100甚至130∶100以上。在針對SRB偏高的干預措施下，2010年后我國SRB開始明顯下降，2020年降到111.3∶100[10]。目前，總人口中男性比女性多3 490萬，造成的婚姻擠壓是客觀存在的，SRB失衡會影響經濟發展和社會和諧。許多生物因素、環境因素會影響自然受孕的SRB，父母年齡較大、母親體重較高、高壓力(社會因素、戰爭、地震、經濟困境)和有害物質接觸(吸煙、污染物、殺蟲劑)等會降低SRB[11-12]。此外，在正常的人類發育過程中，有一種性別偏向的死亡率趨勢，孕期女性胎兒的死亡率總體較高，這被認為是由于母體遺傳的mRNA或胚胎合成的RNA表達中斷所致[13]。另一種理論是，父親的X染色體在一定程度上阻礙了發育，從而增加了女性胎兒死亡率[14]。這兩種理論說明了孕期女性胎兒死亡率的升高會導致SRB升高。

本研究發現，IVF/ICSI-ET總體新生兒SRB為121.6∶100，稍高于我國2010年的SRB 118.1∶100，高于之前文獻報道的自然妊娠SRB(106～110.2∶100)[3]。南方醫科大學南方醫院婦產科生殖中心2008～2014年ART出生嬰兒的SRB為116∶100[15]。廣州醫科大學附屬第三醫院2013～2014年ART的平均SRB為118∶100[16]。由以推測，ART相比于自然妊娠可能會增加男嬰的出生比。

以往諸多研究發現，IVF較ICSI會增加男嬰出生比[1，12，15，17]。本研究結果發現，行IVF受精出生的新生兒SRB為126.2∶100，高于傳統自然妊娠SRB(106～110.2∶100)。張力佳等[15]和王麗等[18]研究報道，行IVF受精出生的新生兒SRB分別為124∶100和128∶100，與我中心的數據相近。本研究結果發現，行ICSI出生的新生兒SRB(107.5∶100)與自然妊娠SRB相近。李磊等[16]研究發現，行ICSI受精出生的新生兒SRB為105∶100，我中心數據與之相近。根據移植胚胎時期或胚胎類型進行亞組分析，在相同移植胚胎時期或胚胎類型的分層中，IVF組SRB顯著高于ICSI組(P<0.05)。Logistic回歸分析發現，受精方式[OR=0.854，95%CI(0.803，0.908)]可能是SRB的獨立影響因素。Supramaniam等[1]統計分析英國1 376 454個治療周期得出，IVF相比于ICSI會增加16%的男嬰出生；受精方式對SRB的影響在調整女性年齡、移植胚胎時期后仍有統計學意義。Bu等[12]分析了中國18個生殖中心共121 247名新生嬰兒，IVF組的SRB顯著高于ICSI組(P<0.05)。

Tarín等[19]的一項Meta分析結果顯示，IVF受精的PSR在129～150∶100之間，ICSI受精的PSR為107∶100。男性射精時含有相同比例的X、Y精子[20]，然而IVF在受精后雄性胚胎比例遠遠高于雌性胚胎。受精方式的差異主要是對X和Y精子的選擇傾向性不同造成的。有學者認為，ICSI主要取決于操作者，一般選擇ICSI的大多是由于男方因素導致的不育，Y精子形態異常多，操作者傾向于找形態正常的精子，因此X精子更容易被選中[16]。而行IVF時，男性胚胎在受精后可能比女性胚胎有發育優勢，透明帶的分子組成可能使卵母細胞更容易被攜帶Y染色體的精子受精，Y精子可能具有較高的受精能力[20]。有研究發現，密度梯度法有利于Y精子的富集，增加Y精子的比例，因此，密度梯度法會增加男嬰的出生[21]。普通的ICSI(非手術取精)和IVF都會用到密度梯度法處理，手術取精的ICSI采用直接離心法處理。為了區分精液處理方法的不同，李磊等[16]將ICSI分為普通ICSI和經皮附睪、睪丸穿刺取精術結合ICSI技術(PESA/TESA-ICSI)，普通ICSI的SRB(113∶100)與IVF的SRB(121∶100)比較無顯著差異(P>0.05)，PESA/TESA-ICSI的SRB(92∶100)顯著低于IVF的SRB(121∶100)(P<0.05)，提示精子的優選方法對SRB影響較大。

以往的研究證明，囊胚移植會增加ART中男嬰的出生比例[17，19，22-23]。本研究結果顯示，移植囊胚的新生兒SRB(129.2∶100)顯著高于卵裂胚移植的新生兒(112.8∶100)(P<0.05)。Chang等[24]的一項Meta分析結果顯示，囊胚移植出生男嬰是卵裂期胚胎移植的1.29倍，本研究結果與之相似。Logistic回歸分析發現，移植胚胎時期[OR=1.192，95%CI(1.114，1.276)]可能是SRB的獨立影響因素(P<0.001)。丁錦麗等[25]的Meta分析結果顯示，囊胚移植組的SRB顯著高于卵裂期胚胎移植組，且不受時間和地域的影響(P<0.001)。以往很多研究移植囊胚的SRB與自然妊娠相比偏高，李磊等[16]研究發現，囊胚移植組的SRB為138∶100，IVF囊胚移植組的SRB為146∶100。田莉峰等[23]研究報道，解凍囊胚移植的SRB為142∶100。劉帥等[26]研究發現，解凍IVF囊胚移植的SRB為142.6∶100。以上結果表明，囊胚移植對性別平衡的影響值得引起重視。

囊胚移植SRB偏高的原因可能有以下幾點：首先，在人類胚胎早期發育中男性胚胎的發育速度明顯高于女性胚胎，自受精后第2天開始，男性胚胎發育速度較女性胚胎至少提前4.5 h且獲得最高形態學評分的胚胎中72%為男性胚胎[27-28]。在挑選胚胎移植時，通常選擇發育良好、形態符合移植標準的胚胎進行移植，因此，男性胚胎被選為優質囊胚進行移植的概率很大[29-30]。Gutiérrez-Adán等[31]研究發現，X染色體上存在6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)和抗氧化酶次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)，這兩個基因可以調控糖代謝和氧化應激，女性胚胎比男性胚胎多1條X染色體，G6PD的雙倍效應使得女性胚胎需要攝取更多的葡萄糖；HPRT的雙倍效應則使女性胚胎中更多的氧自由基被清除，過多的氧自由基對細胞有傷害作用，但適量的氧自由基則有利于細胞的生長。因此，G6PD和HPRT的雙倍效應不利于女性胚胎應對體外培養環境的壓力，最終導致其生長速度要慢于男性胚胎[29]。其次，由于男性胚胎比女性胚胎能更快地吸收丙酮酸和葡萄糖，從而更快地實現囊胚期的發育[22]。再者，囊胚移植后出現更高的繼發性性別比例可能是由于植入后早期女性胚胎優先死亡所致，至少部分是由于兩條X染色體中的1條異常失活(劑量補償機制)導致[32]；另外，Gutiérrez-Adán等[31]研究發現，與IVF比較，ICSI操作過程可致女性胚胎X染色體更早失活，從而使ICSI組女性胚胎體外培養時發育滯后的現象不明顯。

本研究結果發現，解凍胚胎移植的SRB(125.0∶100)略高于新鮮移植(119.3∶100)，但差異無統計學意義(P>0.05)。Logistic回歸分析發現，移植胚胎類型對SRB無顯著影響。Bu等[12]研究發現，解凍胚胎移植可以提高SRB，但Logistic回歸分析顯示解凍胚胎移植與SRB無顯著相關性，這可能與國內大多數中心在解凍周期多采用囊胚移植，而囊胚移植是出生嬰兒性別比的獨立影響因素有關。有研究發現，解凍胚胎移植會增加女嬰的出生比例，分析原因可能與挑選移植和冷凍胚胎的標準有關，選擇形態、發育好的胚胎作為新鮮移植的標準，而冷凍發育相對較差的胚胎或囊胚[33-34]。本研究中的新鮮囊胚移植占29.2%(4 265/14 596)，解凍囊胚移植占93.3%(9 399/10 065)，本中心新鮮移植以卵裂胚為主，解凍移植以囊胚為主，因此解凍移植的SRB略高于新鮮移植，但差異無統計學意義(P>0.05)。不同胚胎類型對SRB的影響跟每個中心的移植策略有關，移植囊胚越多其SRB值就會升高。

本研究結果顯示，單胚胎移植的SRB顯著高于雙胚胎移植(P<0.05)。但是，Logistic回歸分析顯示，移植胚胎數與SRB無顯著相關性。單胚胎移植中囊胚移植占85.6%(3 376/3 944)，雙胚胎移植中囊胚移植占54.7%(10 280/18 783)，而囊胚移植可能會增加ART中男嬰的出生比例，因此，單胚胎移植囊胚占比大可能是單胚胎移植SRB顯著高于雙胚胎移植的原因。孫文楓等[17]研究發現，移植1、2、3枚胚胎的SRB分別為119.4∶100、114∶100及107∶100，可以看出隨著移植胚胎數量的增加SRB有下降趨勢，與我們的研究結果相符。本研究發現，移植1枚卵裂期胚胎的SRB略低于移植2枚卵裂期胚胎，但差異無統計學意義(P>0.05)；而移植單囊胚的SRB略高于移植雙囊胚(P>0.05)，提示移植胚胎數對SRB的影響會受到不同移植胚胎時期的影響。

隨著培養液和培養系統的不斷改進、實驗室人員操作技術的不斷優化、胚胎體外培養環境不斷改良，這些因素的變化是否會對SRB造成影響？為解答上述問題，本研究統計了2010～2019年我院總SRB的變化趨勢發現，SRB沒有明顯逐年升高或者降低的趨勢；同年份中，卵裂胚移植的SRB低于囊胚移植，ICSI的SRB低于IVF。同一中心近些年若是提高了囊胚移植的比例或者提倡單囊胚移植，SRB就可能有升高的趨勢。

綜上所述，ART可能會增加男嬰的出生，行IVF助孕或移植囊胚可能會增加SRB。為了最大程度減少對出生比例平衡的影響，我們可以試著改變精液處理的方法，提高移植卵裂期胚胎的比例，控制性別比，防止性別比失衡，促進ART的健康發展。