小鼠卵母細胞體內成熟過程中CDK1蛋白及其mRNA的動態變化

孫亞婷，賈瑤，朱愛珍

(運城市中心醫院生殖醫學科，運城 044000)

隨著輔助生殖技術的發展，卵母細胞體外成熟技術取得了一定進展。周團萍等[1]的研究表明卵母細胞體內或體外成熟過程中線粒體相關凋亡因子2(AIFM2)和鐵氧化還原蛋白1(FDX1)都參與了卵母細胞成熟過程，且體內和體外成熟的卵丘細胞AIFM2和FDX1表達水平無顯著差異，但體外成熟的卵母細胞發育潛能仍不理想。有研究表明，體外培養的卵母細胞減數分裂成熟率、受精率和囊胚形成率均低于體內成熟的卵母細胞[2]。體外成熟還影響人卵母細胞的基因表達譜，涉及轉錄調控、胚胎發生、表觀遺傳學、發育和細胞周期的幾個基因[3]，體外成熟還有待進一步優化。因此為深入理解卵母細胞成熟的分子機制，本研究選用體內成熟各階段的卵母細胞為研究對象。

卵母細胞成熟是指從生發泡(GV)階段到第2次減數分裂中期的減數分裂過程[4]。該過程的首要表現是在光鏡下觀察到生發泡的消失，稱為生發泡破裂(GVBD)。GVBD后，卵母細胞通過第1次減數分裂中期(MⅠ)，隨后第一極體排出進入第2次減數分裂并停滯在第2次減數分中期(MⅡ)直到受精發生。GVBD的啟動受卵細胞成熟促進因子(MPF)的激活調控。MPF是異二聚體，由催化亞單位——細胞周期蛋白依賴性激酶-1(CDK1，又被稱為cdc2或p34cdc2)和調節亞單位——細胞周期調節蛋白B(cyclinB)組成[5]。CDK1的分子量是34 kDa，通過與cyclin B結合形成MPF，誘導卵母細胞的減數分裂成熟[6-8]，在未成熟卵母細胞減數分裂恢復中起重要作用[9]。但是卵母細胞體內成熟過程中CDK1蛋白和mRNA表達水平的變化及其相關性尚不清楚。本研究通過分別檢測GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細胞CDK1蛋白及其mRNA的表達，闡明CDK1蛋白和CDK1 mRNA在小鼠卵母細胞體內成熟過程中的變化趨勢和相關性，為進一步深入探討卵母細胞成熟機制奠定一定基礎。

材料和方法

一、實驗動物

二、實驗試劑及儀器

孕馬血清促性腺激素(PMSG，M2620)、人絨毛膜促性腺激素(HCG，M2520)、M2培養基(M1250)和即用型透明質酸酶(M2215)均購自南京愛貝生物；放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA裂解液，P0013B)、磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，ST447)、Tris緩沖鹽溶液(TBS，ST667)、含聚山醇脂-20的TBS(TBSTw，ST673)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(6×，P0015F)、100 mmol/L苯甲基硫酰氟(PMSF，ST506)、Tris-硼酸-EDTA緩沖液(TBE，ST723)、InstantViewTM紅色熒光DNA ladder(D0117S)和InstantViewTM紅色熒光DNA上樣緩沖液(D0081)均購自上海碧云天生物；BCA法蛋白定量試劑盒(PQ0012)購自杭州聯科生物；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(AR0138)和Tris-glycine-SDS電泳緩沖液(AR0139)均購自武漢博士德生物；Meilunbiofg超靈敏ECL發光試劑(MA0186-1)購自大連美侖生物；兔抗小鼠CDK1抗體(77055S)和HRP-山羊抗兔IgG抗體(7074)購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗小鼠β-Actin多克隆抗體(20536-1-AP)購自美國Proteintech公司；蛋白marker(26616)購自美國賽默飛世爾；PVDF膜(R0BB30223)購自美國Merck Millipore公司；2M DTT(B645939)、CDK1引物和β-actin引物(B661202)購自上海生工生物；RNeasy Plus Micro試劑盒(Qiagen，74034)購自德國Qiagen公司；PrimeScriptTMRT with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(RR047A)和TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(RR820A)試劑盒均購自日本Takara公司；倒置顯微鏡(DMI3000 B)和體式顯微鏡(S6D)購自德國Leica公司；電泳儀(1645050)、高壓電泳儀(POWER PACTM HC)、半干轉膜儀(1703940)、全能成像系統(chemidoc MP)和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測系統(CFX96 Deepwell)購自美國BIO-RAD公司。

三、實驗方法

1.實驗分組：將68只小鼠隨機分成4組，根據獲取卵母細胞的時期分為GV組、GVBD組、MⅠ組和MⅡ組，每組17只。每組11只小鼠獲取的卵母細胞用于Western blot實驗，剩余6只小鼠獲取的卵母細胞用于qRT-PCR實驗。

2.GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細胞的獲取：參考之前文獻的給藥劑量[10]，給予6～8周齡SPF級ICR雌性小鼠腹腔注射PMSG 10 U。(1)GV期卵母細胞獲取方法：腹腔注射PMSG 48 h后，小鼠頸椎脫臼處死。無菌條件下暴露卵巢，將整個卵巢置于預熱的M2培養基(M1250)，沖洗兩次，用1 ml無菌注射器針頭撕成1 mm×1 mm×1 mm以下小塊。在立體顯微鏡下選擇大小適中、形狀規則的GV期卵母細胞。機械去除顆粒細胞等雜質后將GV期卵母細胞收集到1.5 ml無菌離心管。(2)GVBD和MⅠ期卵母細胞獲取方法：小鼠腹腔注射PMSG 48 h后，注射HCG 10 U，4 h后卵巢獲取GVBD期卵母細胞，8 h后卵巢獲取MⅠ卵母細胞。(3)MⅡ期卵母細胞獲取：小鼠腹腔注射PMSG 48 h后，注射10 U HCG。12 h后，脫臼處死，無菌條件下暴露輸卵管，放入預熱的M2培養基，漂洗兩次，用1 ml無菌注射器針頭撕開，在立體顯微鏡下選擇MⅡ期卵母細胞。顆粒細胞等雜質用透明質酸酶(M2215)去除，將MⅡ期卵母細胞收集于1.5 ml無菌離心管中。

3.Western blot實驗：使用含有1 mmol/L PMSF的150 μl RIPA裂解液分別從200個GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細胞中提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒檢測每個蛋白樣品的濃度，各樣本上樣10 μg的總蛋白進行10%的SDS-PAGE電泳分離條帶，然后將蛋白條帶轉移到PVDF膜中。將PVDF膜在含5%脫脂牛奶的TBST中室溫封閉1 h后與TBST稀釋的兔抗小鼠CDK1一抗(1∶1 500)或兔抗小鼠β-Actin一抗(1∶7 500)在4℃過夜孵育后再與TBST稀釋的HRP-山羊抗兔IgG二抗(1∶4 500)室溫下孵育30 min。采用Meilunbiofg超靈敏ECL發光試劑進行化學發光信號檢測。使用ChemiDocTM成像系統獲取圖像，使用ImageJ 1.8.0軟件對條帶強度進行量化，β-actin作為內參對照。每個實驗使用不同的生物標本重復3次。

4.RNA提取、逆轉錄和qRT-PCR：每50～100個GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細胞分別加入含有2 mmol/L DTT和4 ng/μl載體RNA的350 μl Buffer RLT Plus進行裂解。然后按照RNeasy Plus Micro試劑盒說明書提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA。CDK1和β-actin的逆轉錄引物為RT Primer Mix。沒有逆轉錄酶的逆轉錄反應作為陰性對照，以確認cDNA中沒有基因組DNA污染。使用CFX96 Real-time PCR檢測系統，按照TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行qRT-PCR。CDK1引物序列為，F：5’-AGTTCATGGATTCTTCACTCGT-3’，R：5’-GTGTGTACACTCGTATCGGTAT-3’。循環程序設置為：95℃，30 s(預變性)；95℃，5 s，60℃，30 s，40個循環。將β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量，重復3次實驗。qRT-PCR擴增產物中加入InstantViewTM紅色熒光DNA上樣緩沖液后2%瓊脂糖凝膠電泳擴增條帶，以確認特異性。

四、統計學分析

結 果

一、小鼠卵母細胞體內成熟過程中CDK1蛋白的表達

分別收集200個GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細胞來研究CDK1蛋白表達，β-actin作為內參。Western blot結果顯示，CDK1蛋白在GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期均有表達(圖1A)；隨著卵母細胞的體內成熟，CDK1蛋白表達量持續增加(P<0.05)(圖1B)。

A：Western blot PAGE電泳圖；B：蛋白電泳灰度值定量統計圖：與GV組比較，*P<0.05；與GVBD組比較，#P<0.05；與MⅠ組比較，▲P<0.05。圖1 小鼠卵母細胞體內成熟過程中CDK1蛋白的變化

二、小鼠卵母細胞體內成熟過程中CDK1 mRNA的表達

分別收集50～100個GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細胞，采用qRT-PCR分析CDK1 mRNA表達水平，以β-actin作為內參。CDK1 mRNA在GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期均有表達；與GV期比較，GVBD期和MⅠ期CDK1 mRNA表達水平均顯著下調(P<0.05)，而MⅡ期CDK1 mRNA表達水平顯著上調(P<0.05)(圖2)。

A：qRT-PCR產物電泳圖；B：CDK1 mRNA相對定量統計圖：與GV組比較，*P<0.05；與GVBD組比較，#P<0.05；與MⅠ組比較，▲P<0.05。圖2 小鼠卵母細胞體內成熟過程中CDK1 mRNA的表達

三、小鼠卵母細胞體內成熟過程中CDK1蛋白及其mRNA表達的相關性

采用Spearman相關分析確定CDK1蛋白與mRNA變化的相關性。結果表明，小鼠卵母細胞體內成熟過程中CDK1蛋白表達與CDK1 mRNA表達相關性較差(R=0.200，P=0.800，圖3)。

圖3 小鼠卵母細胞體內成熟過程中CDK1蛋白和mRNA表達的相關性分析

討 論

體外受精周期的未成熟卵母細胞較多可能影響受精及胚胎發育潛能，導致可供移植的胚胎數減少[11]，妊娠率下降[12]。而哺乳動物卵母細胞的成熟是一個復雜的生物學過程[13]。未成熟的卵母細胞不具備受精能力，因為它們缺乏足夠數量的細胞周期調節蛋白，特別是CDK1[14]。在牛GV期卵母細胞生長過程中，其CDK1蛋白逐漸積累[15]。CDK1蛋白含量限制了山羊GV期卵母細胞減數分裂能力的獲得[16]。青春期前山羊GV期卵母細胞在體外培養27 h后其CDK1蛋白表達增加[17]。Chesnel等[18]的研究表明，小鼠體內卵母細胞生長到有能力完成GVBD的時候p34cdc2(CDK1)的合成和積累增加。而不管卵母細胞是否具備減數分裂能力，CDK1 mRNA的濃度都沒有明顯變化[7，14]。但現有研究幾乎都局限于體外培養的或從不同大小卵泡液中獲取的卵母細胞。目前尚無卵母細胞體內成熟不同時期CDK1表達情況的相關報道。

本研究從促排卵小鼠體內分別收集GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母細胞，Western blot結果表明，在GV期向GVBD轉變過程中CDK1蛋白表達增加了近1倍，在GVBD向MⅠ期轉變過程中CDK1蛋白表達增加了30%左右。而de Vant’ery等[19]通過Western blot實驗證實小鼠GV期卵母細胞在體外發生GVBD后CDK1蛋白含量增加了4倍左右，這可能是體外培養上調了GV期向GVBD轉化過程中卵母細胞CDK1蛋白表達譜。本研究通過qRT-PCR分析顯示GV期向GVBD轉變過程中CDK1 mRNA表達下調約20%，在GVBD向MⅠ期轉變過程中CDK1 mRNA表達繼續下調了近1倍，這與Firmani等[14]的體外研究結論不相符，也許是因為目前體外培養條件尚不能完全模擬體內環境，體外成熟改變了卵母細胞成熟相關的CDK1 mRNA的表達譜。由此，我們推測體內卵母細胞從GV期到GVBD、GVBD到MⅠ期轉變過程中CDK1蛋白表達的增加并不是mRNA的表達量增加引起的，可能是由于其它機制使得mRNA翻譯效率提高所致。本研究結果還顯示，從MⅠ到MⅡ期，卵母細胞CDK1蛋白表達增加了近50%，CDK1 mRNA表達增加了4倍多，且MⅡ期卵母細胞的CDK1蛋白和mRNA的積累量達到最大值，這表明小鼠卵母細胞在MⅡ期儲存了足夠的母源CDK1 mRNA和蛋白質，為維持卵母細胞早期卵裂期胚胎的正常發育提供了保障[20]。

進一步的Spearman相關分析表明，小鼠卵母細胞體內成熟過程中CDK1蛋白與其mRNA表達相關性較差，因此可見卵母細胞體內成熟過程中CDK1蛋白的增加并不完全是由轉錄水平的變化引起的，我們推測在轉錄后水平上可能還有其他機制影響CDK1蛋白的翻譯。但還需要進行廣泛而深入的研究，這對闡明人胚胎發育特征以及認識不孕不育等疾病發病機制具有一定的參考意義。