RDS早產兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平變化及相關性研究*

桂冬梅，尹楊艷，陳丹丹，蔡昌君

海南醫學院第一附屬醫院兒科，海南海口 570102

呼吸窘迫綜合征(RDS)屬于肺功能不全類疾病，多見于早產、剖宮產、有窒息史的新生兒，發病時間多在出生后不久[1]。臨床研究指出，多種細胞因子在肺泡氧化應激代償障礙、炎癥損傷等過程中發揮作用，共同推進RDS的發生、發展[2]。研究表明，睪素2(SPOCK2)是睪丸細胞外軟骨素和硫酸乙酰肝素蛋白多糖的成員，與早產兒肺損傷發生有關[3]。抵抗素樣分子β(RELM-β)是一種在肺組織、血液等組織中表達的蛋白，在多種呼吸道疾病中起調節肺纖維化進程，發揮炎癥效應等作用，目前，關于RELM-β參與早產兒RDS的發生、進展的研究少見[4]。還有研究顯示，微小RNA-21(miR-21)的高表達與多種肺部疾病相關，在中，miR-21表達與炎癥反應進程密切相關[5]。目前臨床關于RDS早產兒血清SPOCK2、RELM-β、miR-21水平及三者相關性的研究少見，故對此展開研究，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2020年1月在本院住院的50例RDS早產兒作為研究組，另選取同期于本院產科出生的50例健康早產兒作為對照組。納入標準：(1)符合《實用新生兒學》中新生兒RDS診斷標準[6]，且胎齡<35周；(2)出生12 h內出現發紺、呻吟、吸氣三凹征和呼吸急促，并呈進行性加重；(3)吸室內空氣時經皮血氧飽和度<85%，動脈血氣分析血氧分壓<50 mm Hg，出現中央性發紺，需吸氧才能維持動脈血氣分析血氧分壓>50 mm Hg；(4)胸部X線檢查顯示有磨玻璃樣改變和支氣管充氣征。排除標準：(1)身體畸形早產兒；(2)先天性疾病早產兒；(3)母親有吸煙史早產兒；(4)肺部感染或其他呼吸系統疾病早產兒；(5)全身重要臟器功能不全早產兒；(6)有哮喘、鼻炎家族史早產兒。兩組胎齡、性別、體質量、分娩方式、母親患妊娠期糖尿病和產前使用糖皮質激素情況比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性；研究組新生兒窒息發生率(54.00%)高于對照組(28.00%)，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，受試早產兒家長均知情并簽署同意書。

表1 兩組基線資料比較

組別n分娩方式[n(%)]剖宮產自然分娩母親患妊娠期糖尿病[n(%)]產前使用糖皮質激素[n(%)]研究組5026(52.00)24(48.00)26(52.00)10(20.00)對照組5019(38.00)31(62.00)19(38.00) 8(16.00)χ2/t1.9802.5970.271P0.1590.1070.603

1.2指標檢測

1.2.1病情分度[7]RDS早產兒均行胸部X線檢查，依據胸部X線片表現分級：Ⅰ級，兩肺野透亮度明顯降低，可見網狀影，均勻散在的細小顆粒；Ⅱ級，相較于Ⅰ級病變嚴重，可見支氣管充氣征延伸至肺野中外帶；Ⅲ級：病變明顯加重，支氣管充氣征明顯，心緣、膈面模糊。Ⅳ級：肺野呈白肺，支氣管充氣征呈現似禿葉樹枝狀，心肺界消失。根據胸部X線片分級判斷患兒病情嚴重程度，Ⅰ～Ⅱ級為輕度組(20例)，Ⅲ～Ⅳ級為中重度組(30例)。

1.2.2標本采集 于清晨采集所有受試早產兒空腹靜脈血6 mL，分裝于兩管。一管4 mL(不抗凝)，以轉速3 000 r/min、離心半徑5 cm離心10 min，分離血清；另一管2 mL(抗凝)，以同樣參數離心分離血漿。將分離后獲得的血清、血漿均置于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2.3SPOCK2、RELM-β水平檢測 于-80 ℃冰箱中取出待檢標本，采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清RELM-β、血漿SPOCK2水平，試劑盒均購自上海裕平生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4miR-21水平檢測 取適量血清標本于EP管中，應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測miR-21水平。按照miRNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明書操作步驟，提取總miRNA，以此為模板，按照cDNA合成試劑盒(天根生化科技有限公司)說明書操作步驟，進行反轉錄合成cDNA，反應條件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。以U6為內參，miR-21上游引物為5′-TCGGCGGTAGCTTATCAGACTGA-3′，下游引物為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用Rcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(天根生化科技有限公司)，在qPCR儀上進行擴增反應，反應條件：變性95 ℃ 30 s；退火60 ℃ 20 s；延伸72 ℃ 10s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-21的相對表達水平。

1.2.5隨訪 研究組治療出院后，進行為期6個月的隨訪，電話聯系患兒家屬，對患兒進行體格檢查，評估患兒神經發育狀況，依據患兒神經發育有無損傷，分為預后良好組(38例)和預后不良組(12例)。

1.2.6觀察指標 記錄并比較各組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平，分析研究組SPOCK2、RELM-β、miR-21間的相關性，比較不同病情嚴重程度、預后、臨床病理特征RDS早產兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平，分析SPOCK2、RELM-β、miR-21單獨和聯合檢測對早產兒RDS的診斷價值。

2 結 果

2.1研究組與對照組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較 研究組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 研究組與對照組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較

2.2研究組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平的相關性 Pearson相關分析結果顯示，SPOCK2水平與RELM-β、miR-21均呈正相關(r=0.459、0.552，P<0.05)，RELM-β水平與miR-21呈正相關(r=0.489，P<0.05)，見圖1。

注：A為SPOCK2水平與RELM-β間關系散點圖；B為SPOCK2水平與miR-21間關系散點圖；C為RELM-β水平與miR-21間關系散點圖。圖1 SPOCK2、RELM-β、miR-21間關系散點圖

2.3不同病情嚴重程度RDS早產兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較 中重度組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平高于輕度組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同病情嚴重程度RDS早產兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較

2.4不同預后RDS早產兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較 預后不良組SPOCK2、RELM-β、miR-21水平高于預后良好組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同預后RDS早產兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較

2.5不同臨床病理特征RDS早產兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較 母親是否患妊娠期糖尿病、是否患妊娠期高血壓、是否雙胎或多胎、是否胎膜早破的RDS早產兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；新生兒窒息、母親產前未使用糖皮質激素的RDS早產兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平高于無新生兒窒息、母親產前使用糖皮質激素的RDS早產兒，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同臨床病理特征RDS早產兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較

續表4 不同臨床病理特征RDS早產兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比較

2.6SPOCK2、RELM-β、miR-21單獨和聯合檢測對早產兒RDS的診斷價值 ROC曲線分析結果顯示，SPOCK2、RELM-β、miR-21聯合檢測診斷早產兒RDS的曲線下面積(AUC)、靈敏度、特異度、準確度分別為0.952、90.0%、92.0%、91.0%，高于SPOCK2、RELM-β、miR-21單獨檢測的AUC(0.792、0.695、0.730)、靈敏度(78.0%、76.0%、72.0%)、特異度(76.0%、75.0%、76.0%)、準確度(77.0%、75.0%、76.0%)，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 SPOCK2、RELM-β、miR-21單獨和聯合檢測對早產兒RDS的診斷價值

圖2 SPOCK2、RELM-β、miR-21單獨和聯合檢測診斷早產兒RDS的ROC曲線

3 討 論

RDS是由于早產兒肺發育尚未成熟，各系統功能均不完善，以及肺表面活性物質缺乏或失活所導致的呼吸障礙性疾病，具有較高的病死率。RDS早產兒易發生代謝性酸中毒、炎性因子浸潤，治療難度較大。目前多采用保護性機械通氣等方式治療，可降低RDS早產兒的病死率，然而其效果不太理想。因此，尋找早期診斷早產兒RDS和評估病情嚴重程度的指標有著重要的臨床價值[8-9]。

SPOCK2是骨黏連蛋白家族的細胞外基質鈣黏連蛋白，可能作用于細胞外蛋白酶級聯的調節[10]。有研究表明，SPOCK2與基質金屬蛋白酶(MMP)相互作用，在肺發育中起關鍵作用[11]。陳濤等[12]研究結果顯示，SPOCK2可能參與肺發育過程，在高氧刺激時對肺組織起保護作用，SPOCK2的表達模式可能與肺發育不成熟密切相關。本研究結果顯示，研究組SPOCK2水平高于對照組，且中度組高于輕度組，差異均有統計學意義(P<0.05)，說明SPOCK2水平可以反映患兒的疾病狀態。MMP-14和MMP-16可抑制pro-MMP-2活化，而SPOCK2則通過NH2末端結構域與SPOCK3的羧基(COOH)末端結構域結合，消除MMP-14和MMP-16的抑制作用，從而使得MMP-2激活，最終促進細胞外基質的降解和細胞的遷移、侵襲[13]。

RELM-β最早在結腸被發現，后來被證實在肺等組織中也有表達，RELM-β作為促有絲分裂因子，刺激氣道上皮細胞增殖，促進多種轉化介質的產生，參與肺血管重塑[14]。馬艷英等[15]研究結果顯示，非小細胞肺癌患者RELM-β水平升高，且與非小細胞肺癌病理分期呈正相關，可通過檢測RELM-β水平對非小細胞肺癌進行診斷及病理分期評估。上述結果提示RELM-β與肺部疾病具有一定的聯系。本研究結果顯示，研究組RELM-β水平較對照組高(P<0.05)，且隨著RDS早產兒病情嚴重程度加重，其水平也逐漸升高(P<0.05)。RELM-β具有Th2細胞因子依賴性，可刺激肺血管內皮細胞及平滑肌細胞增殖，促進膠原沉積和參與炎癥反應，從而促進微血管新生，調節毛細血管通透性，改善肺泡氧合，修復肺損傷，改善停滯的肺發育，當病情進展，肺損傷加重時，機體或選擇進一步增加RELM-β的分泌來代償加重的肺損傷[16-17]。

miR-21在心血管系統、呼吸系統等多種疾病中均發揮作用，臨床上對早產兒RDS的治療包括抑制B細胞的增殖[18]。本研究結果顯示，miR-21水平在RDS早產兒中呈高表達(P<0.05)，且隨著患兒病情加重，其水平也逐漸升高(P<0.05)。目前對于miR-21水平升高是否促進RDS早產兒疾病進展尚不清晰。miR-21與抑癌基因PTEN的mRNA結合，抑制PTEN的表達[19]。另外有研究表明，PTEN下調可加強中性粒細胞的功能，提高免疫力，減少肺部細菌感染的發生[20]。在RDS患者中，miR-21上調可降低PTEN表達，對肺部起保護作用。同時，miR-21可逆向調控腫瘤壞死因子-α的表達，而腫瘤壞死因子-α可減少肺表面活性物質表達。所以，miR-21可通過增加肺表面活性物質、增強中性粒細胞功能，進而在RDS中發揮作用[21]。

Pearson相關分析結果顯示，SPOCK2、RELM-β、miR-21互為正相關(P<0.05)；單因素分析結果顯示，新生兒窒息、母親產前未應用糖皮質激素的RDS早產兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平更高(P<0.05)?？赡芤驗橹舷⒃谝欢ǔ潭壬蠐p傷了肺泡上皮細胞，抑制了肺表面活性物質的合成及活性，以致發生RDS。ROC曲線分析結果顯示，SPOCK2、RELM-β、miR-21單獨檢測對早產兒RDS均有一定診斷價值，而這3項指標聯合檢測診斷早產兒RDS的效能要優于單獨檢測的診斷效能，提示檢測患兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平可能有助于RDS的診斷。本研究仍存在不足之處，如納入樣本量較少，結果可能受偏倚影響，需增大樣本量，獲取更為準確的數據，進一步證實本研究。

綜上所述，RDS早產兒SPOCK2、RELM-β、miR-21水平升高且相互呈正相關，3項指標聯合檢測對早產兒RDS的診斷價值較高。