血清miR-223-3p和miR-17-5p水平與前列腺癌患者術后復發轉移的關系及其預測價值分析*

孫江江，劉 博，周少英△，李 敏

邯鄲市中心醫院：1.泌尿外科；2.檢驗科，河北邯鄲 056000

前列腺癌是男性泌尿生殖系統常見的惡性腫瘤，近年來我國男性前列腺癌發病率呈升高趨勢，有報道顯示，2019年我國前列腺癌發病率僅次于肺癌，位居男性惡性腫瘤的第二位[1]。目前，臨床上對于前列腺癌患者主張早期行前列腺癌根治術治療。有研究顯示，采用同一手術方案治療的不同患者預后并不完全相同[2]，提示除手術方案外，前列腺癌患者的預后還與多種因素有關。腫瘤復發和轉移是造成患者死亡的主要原因，研究前列腺癌患者術后復發轉移有效預測指標具有重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)是一類具有調控基因表達功能的內源性小RNA分子，參與機體多種生理、病理過程[3]。已有研究表明，miR-223-3p和miR-17-5p均是能夠調節細胞增殖的miRNA，與惡性腫瘤的發生、發展密切相關[4-5]。有報道顯示，miR-223可以促進胃癌細胞的轉移[6]，miR-17-5p可以促進結直腸癌細胞的增殖和轉移[7]，但兩者是否與前列腺癌患者術后復發轉移有關仍未完全明確。故本研究對本院收治的前列腺癌患者血清miR-223-3p和miR-17-5p水平進行了分析，旨在為前列腺癌患者術后復發轉移的預測提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2017年6月本院收治并行前列腺癌根治術治療的120例患者作為研究對象，另選擇同期30例體檢健康志愿者作為對照組。術前采集患者臨床資料，包括年齡、體質量指數(BMI)、吸煙史、糖尿病史、高血壓病史、前列腺癌家族史、收縮壓、舒張壓、前列腺體積、臨床分期。納入標準：(1)所有患者診斷均符合前列腺癌診斷標準，并經穿刺活檢及術后病理診斷證實為前列腺癌[8]；(2)患者初次患病就診，臨床資料完整；(3)患者具有前列腺癌根治性手術治療指征，未接受放療、化療及免疫治療；(4)患者及家屬對本研究知情同意。排除標準：(1)合并嚴重心、肺、腎功能障礙者；(2)術前合并其他惡性腫瘤者；(3)疾病嚴重，預計術后生存期小于12個月者；(4)生活不能自理，不能完成本研究者；(5)失訪患者。根據納入、排除標準，最終納入的116例行前列腺癌根治術患者作為觀察組，年齡41～78歲，平均(62.14±8.86)歲；BMI 19～27 kg/m2，平均(23.01±2.43)kg/m2；有吸煙史42例，糖尿病史26例，冠心病史16例，高血壓病史33例，前列腺癌家族史6例；術前收縮壓115～145 mm Hg，平均(127.85±15.82)mm Hg；術前舒張壓72～95 mm Hg，平均(78.01±10.12)mm Hg；術前前列腺體積65～80 cm3，平均(71.05±15.56)cm3；臨床分期Ⅰ期35例，Ⅱ期49例，Ⅲ期32例；Gleason評分：≤7分79例，>7分37例。對照組年齡40～80歲，平均(61.07±8.12)歲；BMI 20～28 kg/m2，平均(22.89±2.11)kg/m2。觀察組與對照組年齡、BMI差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會同意。

1.2方法

1.2.1治療方法 所有患者在全身麻醉下行腹腔鏡前列腺癌根治術。患者仰臥位，臍下切口建立人工氣腹，氣腹壓力維持在12～15 mm Hg，經臍下將Trocar置入腹腔鏡，在臍下腹直肌兩側第一Trocar放置5 mm和12 mm Trocar，髂前上棘內側放置5 mm Trocar，置入腔鏡，并進行操作，分離髂血管及神經，清掃脂肪組織及淋巴結組織。切斷恥骨前列腺韌帶，離斷陰莖背深靜脈叢，切開尿道前后壁，并游離精囊，切斷兩側輸精管，切開尿道的前、后、側壁，進行前列腺癌根治術，重建膀胱頸，吻合尿道，縫合切口。術后常規留置導尿，抗感染及補液治療。術后根據不同形態結構的前列腺癌成分占比多少，將前列腺癌分成主要分級區和次要分級區，各區評分范圍為1～5分(分越低，分化越好，惡性程度則越低，反之亦然)，將主要分級區和次要分級區評分相加，即為前列腺癌的Gleason評分，范圍為2～10分。

1.2.2血清的采集及保存 采集患者術前和健康體檢者體檢當日清晨空腹外周靜脈血10 mL，血液標本室溫下靜置10 min，以離心半徑6 cm、轉速3 500 r/min離心10 min，分離血清，將血清置于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2.3血清miR-223-3p和miR-17-5p水平檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測血清miR-223-3p和miR-17-5p水平。應用Trizol(美國Invitrogen生產，批號：20151123)提取血清總RNA，采用美國哈希DR3800分光光度計測量260 nm處的吸光度值在1.8～2.0，表明樣本有效。應用Taq Man RT kit(日本Takara生產，批號：160216)進行反轉錄，提取總cDNA，應用TaqMan MicroRNA assay(廣州銳博生物公司生產，批號160118)進行擴增反應，以U6為內參，引物序列(表1)由蘇州吉瑪有限公司合成。反應體系：cDNA 1.33 μL，TaqMan MicroRNA assay 1.00 μL，Taq Man 2×Universal PCR Master Mix 10.00 μL，ddH2O 7.67 μL，共計20 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，60 ℃延伸60 s，共計45個循環，并重復3次，完成后通過2-ΔΔCt法計算miR-223-3p和miR-17-5p相對表達水平。

表1 miR-223-3p、miR-17-5p及內參U6的引物序列

1.2.4血清前列腺特異抗原(PSA)及睪酮檢測 采用酶聯免疫吸附試驗及配套試劑盒(購自上海恒遠生物科技有限公司)檢測患者血清PSA水平，計算血清游離前列腺特異抗原/總前列腺特異抗原(fPSA/tPSA)；采用羅氏Cobase 601電化學發光分析儀及配套試劑盒(購自廣州兆康生物科技有限公司)檢測血清睪酮水平。均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5隨訪 所有患者通過門診或電話隨訪3年，隨訪截止時間為2020年6月，隨訪期間每3個月通過電話或患者到門診進行復查，如患者出現以下情況則認定為復發轉移：患者血清PSA持續上升或PSA水平連續兩次≥0.2 ng/mL；直腸指檢發現異常硬結；骨掃描CT發現轉移病灶；經直腸超聲檢查或活檢證實轉移[9]。隨訪3年，4例患者失訪，予以剔除，剩余116例患者中，其中37例發生復發轉移的患者作為復發轉移組，79例未發生復發轉移的患者作為未復發轉移組。

2 結 果

2.1觀察組與對照組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平比較 觀察組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平分別為2.664±0.706、3.145±0.923，對照組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平分別為0.829±0.128、1.203±0.221，觀察組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平明顯高于對照組(t=14.141、11.412，P<0.05)。

2.2臨床資料在復發轉移組與未復發轉移組間的比較 復發轉移組與未復發轉移組年齡、BMI，吸煙史、糖尿病史、高血壓病史、前列腺癌家族史患者比例，以及收縮壓、舒張壓、前列腺體積比較，差異無統計學意義(P>0.05)。復發轉移組臨床分期為Ⅲ期、Gleason評分>7分、血清PSA>20.33 ng/mL、fPSA/tPSA≤0.1、睪酮≤3.0 ng/mL的患者比例明顯高于未復發轉移組(P<0.05)，見表2。

表2 臨床資料在復發轉移組與未復發轉移組間的比較或n(%)]

2.3復發轉移組與未復發轉移組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平比較 復發轉移組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平均明顯高于未復發轉移組(P<0.05)，見表3。

表3 復發轉移組患者與未復發轉移組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平比較

2.4前列腺癌患者術后復發轉移的影響因素分析 以前列腺癌患者術后復發轉移情況為因變量(復發轉移賦值1，未復發轉移賦值0)，以表2、3中差異有統計學意義的指標為自變量，建立Cox風險比例回歸模型。回歸過程采用逐步后退法，以進行自變量的選擇和剔除，設定α剔除=0.10，α入選=0.05。分析結果顯示，臨床分期Ⅲ期、Gleason評分>7分、PSA>20.33 ng/mL、fPSA/tPSA比值≤0.1、睪酮≤3.0 ng/mL、miR-223-3p>3.192、miR-17-5p>3.556是前列腺癌患者術后復發轉移的危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 前列腺癌患者術后復發轉移影響因素的Cox風險比例回歸模型分析

2.5miR-223-3p、miR-17-5p及血清PSA單獨和聯合檢測對前列腺癌患者術后復發轉移的預測價值 以復發轉移組為陽性樣本，未復發轉移組組為陰性樣本，繪制ROC曲線，分析結果顯示，血清miR-223-3p、miR-17-5p、PSA單獨檢測預測前列腺癌患者術后復發轉移的曲線下面積(AUC)為0.783(95%CI：0.585～0.975)、0.742(95%CI：0.503～0.977)、0.722(95%CI：0.479～0.964)；3項指標聯合檢測預測前列腺癌患者術后復發轉移的AUC為0.859(95%CI：0.755～0.957)，準確度為0.853(99/116)，均明顯高于3指標單獨檢測。見表5、圖1。

表5 血清miR-223-3p、miR-17-5p、PSA單獨和聯合檢測對前列腺癌患者術后復發轉移的預測價值

圖1 血清miR-223-3p、miR-17-5p、PSA單獨和聯合檢測預測前列腺癌患者術后復發轉移的ROC曲線

3 討 論

前列腺癌發生、發展是一個多因素、多基因參與的復雜過程，患者術后復發轉移是造成患者死亡的重要原因之一[10]。miRNA是一類長度在18～25個核苷酸的內源性非編碼小RNA分子，可與靶基因mRNA 3′端非編碼序列結合，發揮轉錄后調控的作用[11]。研究表明，在機體內miRNA可以調控多種細胞內信號轉導通路，參與細胞增殖、凋亡、分化和遷移等過程，尤其是在惡性腫瘤發生、發展及復發轉移中，miRNA發揮重要的作用[12-13]。

miR-223-3是miR-223家族的重要成員，由一個獨立的啟動子轉錄。有報道顯示，miR-223-3主要在循環系統及肌細胞中高度表達，具有抑制成肌細胞增殖及促進成肌細胞分化的作用[14-15]。近年來有學者發現，miR-223-3可以調節腫瘤微環境及癌基因、抑癌基因的表達水平，進而調節腫瘤的發生、發展[16]。目前研究表明，miR-223-3在調節腫瘤發生、發展中具有促癌和抑癌兩種作用[17-18]。YUAN等[19]報道，在淋巴瘤細胞系中轉染miR-223-3，淋巴瘤細胞的生長速度、集落形成、遷移和侵襲性降低。戚欣等[20]發現，在肝癌SMMC-7721細胞中，miR-223-3水平升高，并通過靶向RAC1促進肝癌細胞增殖，抑制肝癌細胞凋亡，從而促進肝癌的發生。miR-17-5p是miR-17-92簇中最重要的成員之一，是細胞增殖、自噬和凋亡等基本過程的重要調節因子[21]。目前研究發現，miR-17-5p在乳腺癌[22]、結直腸癌[23]、肺癌[24]和卵巢癌[25]中呈高表達，其水平與腫瘤的侵襲性和對化療藥物治療的反應性有關。本研究發現，觀察組術前血清miR-223-3p、miR-17-5p水平明顯高于對照組(P<0.05)，且復發轉移組血清miR-223-3p、miR-17-5p水平也明顯高于未復發轉移組(P<0.05)，表明miR-223-3p、miR-17-5p可能促進前列腺癌的發生、發展，與前列腺癌術后復發轉移及預后有關。推測其可能原因：PI3K/AKT信號通路是腫瘤發生發展的重要信號通路，在前列腺癌中存在PI3K/AKT信號通路的異常激活，并影響基質金屬蛋白酶的表達，后者起到降解細胞外基質，促進前列腺癌表皮細胞向間質細胞轉化的作用；另外，PI3K/AKT信號通路還可以促進肌動蛋白的細絲重構，提高腫瘤細胞的運動能力[26]。郭金蘭等[27]報道，miR-17-5p可以靶向PI3K/AKT信號通路，調控皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡。ZHU等[28]報道，在胰腺癌中，下調microRNA-223水平可抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，從而抑制胰腺癌的發生。因此，本研究推測，miR-223-3p、miR-17-5p可能激活PI3K/AKT信號通路，升高基質金屬蛋白酶的水平，從而增加細胞外基質的降解，促進前列腺癌表皮細胞向間質細胞轉化及肌動蛋白的細絲重構，進而促進前列腺癌的復發轉移。

本研究結果顯示，復發轉移組臨床分期為Ⅲ期、Gleason評分>7分、血清PSA>20.33 ng/mL、fPSA/tPSA≤0.1、睪酮≤3.0 ng/mL的患者比例明顯高于未復發轉移組(P<0.05)。臨床分期為Ⅲ期的患者腫瘤進展快，治療難度大，術后發生復發轉移的風險也較高[23]。Gleason評分是目前臨床上廣泛采用的前列腺癌組織分級方法，與前列腺癌的生物行為和預后具有很高的關聯性，Gleason評分>7分為高危前列腺癌，患者術后發生復發轉移的風險也較高[29]。PSA是一種含有237個氨基酸的多肽分子，正常情況下由前列腺產生，僅少量存在，具有分解精液中的主要膠狀蛋白的作用[30]。當發生前列腺疾病時，血清PSA水平會升高，其表達具有組織特異性[31]。fPSA/tPSA、睪酮也是目前臨床上診斷前列腺癌的重要指標，本研究結果表明上述指標與前列腺癌復發轉移及患者預后有關。

miR-223-3p、miR-17-5p水平升高可能通過調節腫瘤微環境及癌基因水平來提高前列腺癌的侵襲和轉移能力[32-33]，而PSA是評價前列腺疾病的重要血清學標志物，提示miR-223-3p、miR-17-5p與血清PSA在評價前列腺癌上可能有很好的一致性。本研究結果還顯示，臨床分期為Ⅲ期、Gleason評分>7分、血清PSA>20.33 ng/mL、fPSA/tPSA≤0.1、睪酮≤3.0 ng/mL、miR-223-3p>3.192、miR-17-5p>3.556是前列腺癌患者術后復發轉移的危險因素。因此，對于存在以上因素的前列腺癌患者應予以警惕，并有針對性的采取多學科協同治療，以改善患者預后。ROC曲線分析結果顯示，miR-223-3p、miR-17-5p、PSA單獨檢測預測前列腺癌術后復發轉移均有較高的靈敏度、特異度，但值得注意的是在前列腺炎、良性前列腺疾病中也可能出現PSA水平升高，臨床上應注意鑒別[34]，故常采用3項指標聯合檢測，以改善對前列腺癌術后復發轉移預測的準確性。

綜上所述，血清miR-223-3p、miR-17-5p水平與前列腺癌患者術后復發轉移有關，二者對前列腺癌術后復發轉移的預測具有較高價值。臨床分期、Gleason評分和血清PSA、miR-223-3p、miR-17-5p水平升高，以及fPSA/tPSA、睪酮水平降低是前列腺癌患者術后復發轉移的危險因素，對存在這些危險因素的患者，應早期給予綜合治療，以改善患者預后。