CRKP對頭孢他啶-阿維巴坦的耐藥性及碳青霉烯酶表型的分析*

吳海燕，孫 霞，張 鋒，姜梅杰，張志軍，曹身云△

1.青島大學附屬泰安市中心醫院重癥醫學科，山東泰安 271000；2.濱州市婦幼保健院檢驗科，山東濱州 256600；3.青島大學附屬泰安市中心醫院超聲診療中心，山東泰安 271000；4.青島大學附屬泰安市中心醫院檢驗科，山東泰安 271000

肺炎克雷伯菌(KP)是我國臨床感染性疾病的第二大致病菌，可引起呼吸系統、泌尿系統和組織感染等[1]。近年來，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)不斷出現，且檢出率呈迅速上升趨勢，給人類健康造成嚴重威脅[2-3]。CRKP通常呈現泛耐藥，僅有多黏菌素和替加環素敏感性較好，但由于藥物不良反應等原因[4]，臨床醫生常無藥可用。因此，迫切需要一種新的、有效的抗菌藥物來治療CRKP引起的感染。頭孢他啶-阿維巴坦(CZA)是一種新型的β-內酰胺合劑，阿維巴坦能夠抑制多種類型的β-內酰胺酶，保護頭孢他啶的殺菌作用[5]，可用于治療CRKP的感染[6]。由于該藥在我國上市時間較短，對其耐藥性的研究和報道較少，為此，本研究就CRKP對頭孢他啶-阿維巴坦的耐藥性及碳青霉烯酶表型進行分析，以期為臨床治療CRKP感染提供理論依據。

1 資料與方法

1.1菌株來源 本研究菌株來源為泰安市中心醫院2020年6月1日至2021年12月31日從臨床標本中分離培養出的100株非重復CRKP。CRKP定義為對亞胺培南、美羅培南或厄他培南中任何一種藥物耐藥的肺炎克雷伯菌[7]。質控菌株：大腸埃希菌ATCC25922。

1.2儀器與試劑 Autof ms1000全自動微生物質譜儀和巧克力平板為鄭州安圖生物有限公司產品。CZA紙片為英國Oxiod公司產品。CZA的E-test條為溫州康泰生物科技有限公司產品，NG-Test CARBA5碳青霉烯酶檢測試劑盒為復星診斷科技(上海)有限公司產品。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定 細菌的分離培養嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》第三版[8]進行。取巧克力平板純化培養過夜的單個菌落采用Autof ms1000全自動質譜儀進行菌株鑒定。

1.3.2CZA藥敏試驗 CZA藥敏試驗首先采用紙片擴散法進行，抑菌圈直徑≥21 mm為敏感，抑菌圈直徑≤20 mm為耐藥。對于抑菌圈直徑在20～22 mm的細菌，由于紙片擴散法容易出現假敏感或假耐藥，因此用CZA的E-test條進行復核[9]。藥敏試驗和結果判讀參照2021年美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗執行標準M100[9]。

1.3.3碳青霉烯酶表型檢測 采用膠體金免疫層析法檢測細菌所產碳青霉烯酶的表型[10-11]，具體試驗方法和結果判讀參照試劑盒說明書。將檢測卡和提取緩沖液平衡至室溫，滴入5滴(約150 μL)提取緩沖液于無菌EP管中。使用1 μL無菌接種環取巧克力平板純培養過夜的細菌，在EP管管壁輕輕研磨，形成均勻的細菌混懸液。使用一次性移液管，吸取5滴(約100 μL)制備好的細菌混懸液，加入檢測卡標記了“S”的標本孔中，室溫放置15 min，讀取結果。如果只有C線區域出現一條紅線，說明標本中不含檢測試劑盒所檢測的5種碳青霉烯酶或碳青霉烯酶含量低于檢測試劑盒的檢測限，判讀為陰性結果。如果在C線區域出現一條紅線，并且在K、O、V、I、N線區域出現一條或者多條紅線，判讀為陽性結果。如果C線區域未出現紅線，說明測試結果無效。

1.4統計學處理 CZA耐藥率統計應用WHONET5.6軟件，計數資料采用頻數、率表示。參照2021年美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗執行標準M100進行統計分析。

2 結 果

2.1CZA藥敏試驗結果 100株CRKP中對CZA耐藥24株，敏感76株，CZA的耐藥率為24%(24/100)。

2.2膠體金免疫層析法碳青霉烯酶結果 100株CRKP中，產KPC型碳青霉烯酶的73株(73%)，產NDM型碳青霉烯酶的10株(10%)，同時產KPC、NDM型碳青霉烯酶的12株(12%)，同時產IMP、NDM型碳青霉烯酶的1株(1%)，未檢出碳青霉烯酶的4株(4%)。見圖1、表1。

注：從左至右依次為產KPC、NDM、KPC+NDM、IMP+NDM型碳青霉烯酶。圖1 膠體金免疫層析法碳青霉烯酶檢測結果

表1 對CZA不同耐藥性的CRKP碳青霉烯酶檢測結果(n)

3 討 論

2020年中國細菌耐藥監測網結果顯示，KP對亞胺培南和美羅培南的耐藥率從2005年的3.0%和2.9%上升至2020年的23.2%和24.2%[12]。尤其是長期住院和住重癥監護室的患者，CRKP的檢出已不再罕見。CRKP對常用抗菌藥物耐藥率高，常呈現泛耐藥，只有多黏菌素類和替加環素敏感性較好。但由于多黏菌素與較高的腎毒性風險相關，而且靜脈使用可能對肺炎無效[9]。替加環素常規劑量使用時治療效果不理想，高劑量使用時，副作用也隨之增大，而且不適用于泌尿系感染[9]，導致臨床常面臨無藥可用的境地[13]。因此，急需一種新型有效的抗菌藥物來治療CRKP導致的感染。CRKP對碳青霉烯類藥物耐藥的機制有：產碳青霉烯酶、外膜蛋白缺失、主動外排系統活躍等。其中最主要的機制是產碳青霉烯酶，CRKP中常見的碳青霉烯酶有KPC、NDM、IMP、OXA、VIM等[14]。

CZA是美國食品和藥品監督局第一個批準的用于治療碳青霉烯耐藥腸桿菌目細菌所致感染的新型β-內酰胺合劑。CZA是三代頭孢菌素頭孢他啶和新型酶的抑制劑阿維巴坦相結合，其中阿維巴坦比傳統的β-內酰胺酶抑制劑具有更高的分子活性，可以抑制多種類型分解頭孢他啶的β-內酰胺酶，而保護頭孢他啶的殺菌作用。阿維巴坦可以抑制的β-內酰胺酶包括A類酶(如KPC-2等)、C類酶和某些D類酶(主要是OX-48等)，但對B類金屬酶無抑制作用，如NDM、IMP、VIM等[5,15]。阿維巴坦的作用機制與傳統的β-內酰胺酶抑制劑有所不同，主要區別在于傳統的β-內酰胺酶抑制劑在與β-內酰胺酶結合時，結構被破壞而失活；而阿維巴坦在與β-內酰胺酶共價結合的過程中不會被水解，經環合形成內酰胺環后，阿維巴坦的活性又可以恢復[5]。而且阿維巴坦不會誘導β-內酰胺酶產生[16]，這也是優于傳統β-內酰胺酶的重要特點。CZA可用于治療碳青霉烯耐藥腸桿菌目細菌所引起的醫院獲得性和呼吸機相關性細菌性肺炎、泌尿系感染、腹腔感染等疾病[5]，是治療產KPC和OXA-48型碳青霉烯酶腸桿菌目細菌的最佳選擇[16]。

本研究中CRKP對CZA的耐藥率為24%(24/100)，高于周琴等[17]報道的成都地區16.67%的耐藥率，與許曉波[18]的研究結果(24.8%)基本一致。本研究中對CZA耐藥的CRKP有24株，其中產NDM型碳青霉烯酶的有10株，同時產KPC、NDM型碳青霉烯酶的有12株，同時產IMP、NDM型碳青霉烯酶的有1株，未檢出碳青霉烯酶的1株；對CZA敏感的CRKP有76株，其中產KPC型碳青霉烯酶的73株，未檢出碳青霉烯酶的3株。本研究中產KPC型碳青霉烯酶的CRKP對CZA的敏感率為100%(73/73)，而所有產NDM型碳青霉烯酶的CRKP對CZA的耐藥率為100%(23/23)。因此，對于CRKP導致的感染，應首先明確細菌所產碳青霉烯酶的類型。當CRKP產KPC型碳青霉烯酶時，其對CZA的敏感性較好，可以選擇用CZA來抗感染治療；而當CRKP產NDM型碳青霉烯酶時，通常對CZA耐藥，應避免使用CZA進行治療。此外，對于產金屬酶的CRKP選擇CZA和氨曲南進行聯合用藥也有治療成功的報道[19-20]。

本研究中CRKP以產KPC型碳青霉烯酶為主(占73%)，與相關文獻報道一致[21]。4株CRKP未檢出碳青霉烯酶，可能的原因有：該碳青霉烯檢測試劑盒只能檢測KPC、NDM、 IMP、VIM、OXA等五種常見的碳青霉烯酶表型，若細菌含有SME、IMI等不常見的碳青霉烯酶表型則無法檢出；也可能是細菌存在除產生碳青霉烯酶以外的耐藥機制，如膜孔蛋白缺失或突變使膜的通透性下降或主動外排系統活躍等。

綜上所述，本院CRKP以產KPC型碳青霉烯酶為主，其次是同時產KPC、NDM型碳青霉烯酶及產NDM型碳青霉烯酶。CRKP產KPC型碳青霉烯酶時對CZA的敏感性較好，產NDM型碳青霉烯酶時對CZA的敏感性較差。因此對于CRKP導致的感染，首先要明確細菌所產碳青霉烯酶的表型，才能更好地指導臨床合理使用抗菌藥物。