高同型半胱氨酸血癥人群的腸道菌群特征研究

趙梓汝，李業榮，賈海英，王珍，胡峰，孟令軍，劉彧

1.中央廣播電視總臺辦公廳醫療保障處，北京 100859；2.中國人民解放軍戰略支援部隊特色醫學中心特勤健康管理科

腸道微生物在人體內部形成龐大而復雜的微生態系統，在調控多種腸道內外疾病風險中起著至關重要的作用，尤其對腹腔疾病、代謝綜合征、心血管疾病和肥胖等有著較大的影響[1]。目前，國內外對人體內同型半胱氨酸(Hcy)水平與腸道菌群結構和相關益生菌豐度之間聯系的研究欠缺，有限的相關研究也主要來自嚙齒動物實驗。有研究表明,補充益生菌可減輕高Hcy引起的損傷，改善尿毒癥者的腸上皮屏障功能[2]。高蛋氨酸飲食會改變小鼠腸道菌群，增加擬桿菌門(Bacteroidetes)和卟啉單胞菌科(Porphyromonadaceae)細菌的相對豐度[3]。通過限制飲食中的蛋氨酸攝入，可以提升小鼠腸道菌群中一些能產生短鏈脂肪酸(SCFA)的細菌種群豐度，并同時減少一些產生脂多糖(LPS)和促炎的菌群豐度[4]。

本研究采用Illumina Hiseq 2500高通量基因測序平臺的16S rRNA測序技術對20例高Hcy組和37例健康對照組的糞便細菌基因組進行分析，探討Hcy水平與腸道微生物組結構的聯系，為深入研究人體內Hcy和腸道菌群分布特征提供參照，并為高Hcy相關疾病的致病因素研究和相關益生菌治療提供證據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究共納入2019年10月至2020年10月在中國人民解放軍戰略支援部隊特色醫學中心體檢的57例志愿者，將受試者嚴格分為高Hcy組和健康對照組，其中20例Hcy水平較高成年人群為高Hcy組，37例為同期在該院體檢的Hcy正常的成年健康人群為健康對照組。納入標準：年齡范圍18～63歲,常住地為北京市。排除標準：胃腸道疾病等嚴重腸道菌群紊亂病史者，6個月內服用過抗生素或益生菌等影響腸道菌群結構的藥物者。本研究經過中國人民解放軍戰略支援部隊特色醫學中心倫理委員會審查和批準，并得到全部研究對象書面的知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 糞便樣本采集及DNA提取 在體檢時使用無菌器皿收集57例研究對象的新鮮糞便樣品5.0 g，置于無菌冷凍試管中，封口后于1 h內送至中國科學院微生物研究所實驗室中，稱取2.00 g糞便，余置于-80 ℃超低溫冰箱內保存。提取樣本總DNA，DNA提取通過Kit KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase試劑盒進行，使用VORTEX-5渦旋振蕩器結合QMGEN Vonex適配器按照操作手冊流程完成核酸純化(組織樣本選擇使用組織勻漿儀)。使用Nano Drop查看核酸的純度和濃度，將DNA樣品存放于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 高同型半胱氨酸血癥(HHcy)標準 根據HHcy診療專家共識[5]：參照成人HHcy共識標準，及共識中我國成人血正常值在13～14 μmol/L之間，將血Hcy≥15 μmol/L者納入高Hcy組。

1.2.3 16S rRNA基因測序 將檢測合格的微生物DNA樣本按指定區域進行PCR擴增、文庫制備、文庫質檢、定量，使用設定的TAG序列進行樣本區分。采用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺對檢測合格的文庫進行測序。第1次擴增時，使用16S rRNA V3-V4區的通用引物[338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)]進行擴增，純化后，進行第2次擴增，引入index序列，文庫均一化后進行上機測序。根據barcode序列區分樣本，提取的數據以標準fastq格式保存。根據PE reads之間的overlap采用Flash軟件對數據進行拼接，對原始測序數據進行數據清洗，分析數據只保留高質量(Q值≥25)的堿基比例大于等于90%的reads，否則舍棄。采用QIIME軟件中的usearch 8.0軟件進行嵌合體序列的檢測及過濾。

1.3 生物信息學分析

1.3.1 物種分類與豐度分析 將原始數據拼接、過濾、去嵌合體后，留下有效TAG。根據97%的序列相似性水平，利用QIIME軟件包中的Uclust方法進行Operational Taxonomie Units(OTU)聚類分析。

基于Silva參考數據庫，對每個樣品的OTUs進行物種分類學(Taxonomy)注釋，對樣本腸道菌群分別進行物種組成和分類分析。

1.3.2 α多樣性分析 α多樣性是指一個特定區域或生態系統內的多樣性。多樣性指數是反映樣本中微生物豐富度和均勻度的綜合指標。本研究根據OTU豐度表，分別檢測并計算2組樣品中物種數量、菌群豐度Chao指數、多樣性指數Shannon指數及Simpson指數，對人群的腸道菌群群落進行α多樣性分析。Chao指數越大，表示樣本中微生物物種數量越多，Shannon指數越大、Simpson指數越小，表示樣本中微生物群落多樣性越高。

1.3.3 β多樣性分析 β多樣性分析是對不同樣本的微生物群落構成進行比較分析。根據歸一化的OTU豐度表進行PCoA主坐標分析，對腸道菌群豐富度和均勻度進行β多樣性分析。

1.3.4 LEfSe差異分析 使用LEfSe(LDA Effect Size)分析來探究高Hcy組和健康對照組腸道菌群之間豐度差異特征，并找到與豐度有統計學差異的類群，同時采用線性判別分析(LDA)來估算不同物種豐度對組間差異效果影響的大小，判定差異的物種。

1.4 統計學方法 使用R軟件包進行統計分析，對組間差異進行t檢驗或wilcoxon rank sum test，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組人群特征描述 高Hcy組和健康對照組年齡分別為(50.0±8.0)歲和(49.2±6.3)歲,差異無統計學意義(P>0.05)。高Hcy組男性占100%，健康對照組男性占78.4%。在健康體檢人群中女性HHcy者較少。

2.2 樣品測序數據分析 57份糞便樣品腸道菌群16S rRNA測序數據經數據過濾和嵌合體序列檢測并去除后，共得到5 499 806條有效序列，總樣品平均有效序列為96 487.82條，樣本的Q20均在90%以上。選擇相似水平為97%的OTU，獲得的OTU總數為2 006個，其中2組共有的OUT為994個，高Hcy組有特有的屬5個，健康對照組有特有的屬13個。

2.3 α多樣性分析 所有樣本的腸道菌群α多樣性分析箱形圖見圖1。以Hcy-H表示高Hcy組樣本，以Hcy-L表示Hcy正常的健康對照組樣本。α多樣性分析結果顯示，高Hcy組樣本腸道菌群的微生物物種數量多于健康對照組，但并未顯示出明顯區別(P=0.20)。其他多樣性指數上，仍表現為高Hcy組樣本高于健康對照組，但未顯示出統計學差異(P>0.05)，表示2組間的腸道菌群多樣性無明顯差異，僅表現為隨同型半胱氨酸升高而增加的趨勢。

圖1 α多樣性分析箱形圖

2.4 β多樣性分析 所有樣本的腸道菌群β多樣性分析主坐標分析PCoA圖，見圖2?；谙到y發育樹未加權的Unifrac距離矩陣主坐標分析，高Hcy組樣本之間物種豐度和構成較遠，而健康對照組樣本之間的關系則更近。高Hcy患者腸道菌群結構與健康對照組人群腸道菌群結構有一定的差異,但差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 未加權Unifrac主坐標分析的PCoA圖

2.5 群落相對豐度 高Hcy組和健康對照組之間糞便菌群組成有一定差異。圖3為在門水平的腸道菌群相對豐度柱狀圖，展示了所占豐度比重前15的物種。數據顯示，擬桿菌門(Bacteroidetes)在高Hcy組和健康對照組中都占據最大的比重，分別占全部腸道菌群的46.43%和49.48%，但2組之間差異無統計學意義(W=308,P>0.05)。其次是厚壁菌門(Firmicutes)，分別占41.51%和37.65%，2組之間差異也無統計學意義(W=441,P>0.05)。其余細菌按相對豐度比重大小為變形菌門(Proteobacteria)，分別占7.39%和6.04%，2組之間差異無統計學意義(W=303,P>0.05)、放線菌門(Actinobacteria)，占4.01%和4.27%，2組之間差異無統計學意義(W=268,P>0.05)、梭桿菌門(Fusobacteria)，占0.11%和1.40%，2組之間差異有統計學意義(W=498.5,P<0.05)、疣微菌門(Verrucomicrobia)，占0.3%和0.98%，2組之間差異無統計學意義(W=255.5,P>0.05)、藍細菌(Cyanobacteria)占0.05%和0.03%，2組之間差異無統計學意義(W=344,P>0.05)。故在門水平，僅梭桿菌門的豐度在健康對照組腸道菌群中顯著高于高Hcy組樣本。

圖3 門水平腸道菌群群落結構柱狀圖

腸道菌群的微生物組成展現出一定的個體差異，尤其在健康對照組中，如擬桿菌門在樣本中所占比重最高達81.93%，最低為18.40%，該最大最小值皆出現在健康對照組中。厚壁菌門在樣本中所占比重最大值為73.74%，最小值為15.20%，也出現在健康對照組中。

在基于屬水平的相對豐度分析顯示，屬水平上豐度較高的細菌在2組之間有較大差異。占全部腸道菌群比重最大的是擬桿菌屬(Bacteroides)，在高Hcy組樣本中占35.19%，在健康對照組中占29.11%，2組之間差異無統計學意義(W=431，P>0.05)。其后依次是普雷沃氏菌屬(Prevotella9)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、布勞特氏菌屬(Blautia)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、毛螺菌屬(Lachnospira)，各屬2組之間均差異無統計學意義(P>0.05)，Fusicatenibacter在高Hcy組中占2.46%，在健康對照組中占1.31%，2組之間差異有統計學意義(W=596，P<0.01)，大腸桿菌志賀氏菌(Escherichia-Shigella)在高Hcy組中占2.24%，在健康對照組中占1.16%，2組之間差異有統計學意義(W=515，P<0.05)，羅斯氏菌屬(Roseburia)在高Hcy組中占1.09%，在健康對照組中占1.86%，2組之間差異有統計學意義(W=538，P<0.01)，而直腸真桿菌(Eubacteriumrectalegroup)、另枝菌屬(Alistipes)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、巨單胞菌屬(Megamonas)、狄氏副擬桿菌(Parabacteroides)、巴恩斯氏菌屬(Barnesiella)各屬2組之間均差異無統計學意義(P>0.05)。故在屬層次，Fusicatenibacter、大腸桿菌志賀菌、羅斯氏菌屬在高Hcy組樣本中的豐度均顯著高于健康對照組。其余屬并未在2組之間表現出具有統計學意義的平均豐度差異。

2.6 LEfSe差異分析 使用線性判別分析(LDA)和進化分支圖來探究LEfSe(LDA Effect Size)差異分析(圖4)。結果顯示，在OTU水平上，高Hcy組和健康對照組樣本的微生物群的優勢種群和系統發育分布都存在一定差異。圖4左圖為針對高Hcy組和健康對照組中具有>2.0的差異豐度的特征計算的LDA值分布柱狀圖(log10)，右圖為進化分支圖，以不同顏色表示了在2組樣本組中起到重要作用的微生物類群。根據設置的LDA值標準，在高Hcy組的腸道菌群中，共有13種有顯著差異的細菌展現出較高的影響力，分別為普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、巨單胞菌屬(Megamonas)、副薩特氏菌屬(Parasutterella)、柯林斯氏菌屬(Collinsella)、紅椿桿菌綱(Coriobacteriia)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、球腸菌科(Enterococcaceae)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)和瘤胃球菌(RuminococcusGauvreauiiGroup)。

高Hcy組腸道菌群中最豐富的差異菌群主要為普雷沃氏菌屬(Prevotella9)和巨單胞菌屬(Megamonas)(LDA值>3)。在健康對照組中，共有11屬顯著差異的細菌展現出較大的影響，其中最占優勢的主要差異細菌類群為艾克曼菌(Akkermansia)和疣微菌屬(Verrucomicrobiaceae)(LDA值>3)。

LEfSe分析生成的進化分支圖(圖4右圖)，顯示了2組樣品群落中由門至屬的分類級別上，豐度差異最大的細菌類群。

圖4 通過LDA分數和LEfSe分析對高Hcy組和健康對照組的腸道菌群進行表征：黃色圈表示無顯著差異的物種，紅色圈表示高Hcy組樣本中起到重要作用的微生物類群，綠色圈表示健康對照組中起到重要作用的微生物類群，圈的直徑大小與相對豐度大小成正比

3 討論

研究證實腸道菌群與人體能量代謝和多種慢性疾病有密切關系。本研究對高Hcy組和健康對照組腸道菌群樣本進行16S rRNA測序分析，以檢測其核心細菌分布，最終發現高Hcy組的腸道菌群與健康人群相比，有多種細菌在高Hcy組腸道菌群中有著與健康對照組明顯不同的豐度。在門層次，放線菌門、梭桿菌門和疣微菌門的豐度在健康對照組腸道菌群中顯著高于HHcy樣本組。在屬層次，Fusicatenibacter、大腸桿菌志賀氏菌、羅斯氏菌屬在高Hcy組樣本中的豐度均顯著高于健康對照組。Fusicatenibacter屬于厭氧梭狀芽孢桿菌，在食物中與食物的總抗氧化能力(T-AOC)呈正相關[6]。在人體腸道菌群中，FusicatenibacterSaccharivorans作為一類有益菌，以葡萄糖為底物，會產生一些具有抗炎作用的短鏈脂肪酸(SCFA)作為發酵終產物，如乳酸、乙酸和琥珀酸，且同時能通過誘導結腸黏膜固有層單核細胞(LPMC)產生白細胞介素(IL)-10，最終可在人體中起到預防腸道炎癥的作用[7-8]。大腸桿菌志賀氏菌則作為一種有害菌，會產生志賀毒素，有研究顯示其豐度與人體中促炎細胞因子IL-1β、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3和趨化因子配體2的濃度呈正相關[9]。羅斯氏菌屬為桿狀革蘭陽性厭氧菌，有研究顯示其在人體腸道中可影響多種代謝途徑，且可能與包括腸應激綜合征、肥胖癥、2型糖尿病、神經系統疾病和過敏等多種疾病相關[10]。高Hcy組腸道菌群中最豐富的差異細菌類群(LDA>3)為普雷沃氏菌屬和巨單胞菌屬。普雷沃氏菌可刺激腸上皮細胞產生IL-8、IL-6和趨化因子配體20，從而促進腸黏膜輔助性T細胞17免疫反應和嗜中性白細胞募集，促進一些慢性炎癥的產生和發展，甚至可能引起更大的全身性疾病[11]。巨單胞菌屬相關的研究則較少，有研究發現其未曾在歐美人群樣本中作為腸道菌群優勢微生物出現，故推測其可能是亞洲人腸道菌群中特有的優勢種，對該屬細菌在人體內各項生理生化及代謝的研究尚有探究空間[12]。因此，在高Hcy組腸道菌群中，長期高蛋氨酸的飲食可能為Fusicatenibacter、大腸桿菌志賀氏菌、羅斯氏菌屬、普雷沃氏菌屬和巨單胞菌屬提供了更好的生長和繁殖環境。除了Fusicatenibacter可產生抗炎作用的短鏈脂肪酸和巨單胞菌的特性尚不明確外，其余4種細菌都會通過其代謝產物和分泌物對腸道上皮細胞和黏膜造成一定的破壞，最終促進炎癥的形成，甚至造成全身性的慢性疾病，對人體內環境帶來負面影響。本研究對于人體內HHcy水平與這些關鍵生物標志物種類有關聯這一事實提供了一定的數據基礎和支持。而對于其他優勢細菌與Hcy水平及相關疾病之間的聯系，還需進一步探究。

本研究有一定的局限性。在本研究中，高Hcy組樣本和健康對照組的α多樣性并無統計學區別，顯示人體Hcy水平并不會對腸道菌群的物種多樣性有太大的影響，推測這可能是因為Hcy的主要來源是飲食中較多的蛋氨酸和較少的維生素，食物中的蛋氨酸由D-蛋氨酸和L-蛋氨酸兩種形式存在，其中D-蛋氨酸本身對維持腸道菌群穩態、防止腸道損傷有一定作用[13]，故腸道菌群在多樣性層面上并無明顯差異。這與研究對象樣本量較少有關，需擴充樣本進一步研究。若樣本量能進一步增大，α多樣性或許能呈現更顯著的區別。此外，盡管有嚴格的納入和排除標準，樣本之間的個體差異依舊比較明顯。更大樣本量的研究也許能更好地闡明腸道微生物群落結構對不同血清Hcy水平的影響。

4 結論與展望

高Hcy組的腸道菌群與血液中Hcy水平正常的健康對照組人群腸道菌群在組成上存在一定差異，腸道菌群群落結構與高同型半胱氨酸血癥的發生和多項Hcy相關疾病的發展可能存在密切聯系。目前國內外對于該領域的研究仍相對較少，僅有的文獻也多為嚙齒動物實驗數據所得。本研究提供了高Hcy組與正常水平Hcy健康對照組人體內腸道菌群區別的描述，結果表明，在高Hcy組人群體內，Fusicatenibacter、大腸桿菌志賀氏菌、羅斯氏菌屬、普雷沃氏菌屬和巨單胞菌屬有著比健康對照組明顯更高的豐度。該研究結果有助于闡明不同Hcy水平下腸道菌群的組成，為進一步明確腸道菌群對Hcy水平的影響提供了數據支持，也為對Hcy水平相關疾病的控制和采用益生菌治療手段提供了新思路。