陽離子脂質體體外轉染實驗條件的優化研究

李洪梅， 姜恩平，裴軼勁，孫艷芹，尹金寶

（廣東醫科大學1. 病理學系2. 生理學教研室，廣東 東莞 523808）

陽離子脂質體是被公認的有研發前景的基因傳遞載體。其結構可分為三部分，即帶正電荷的陽離子頭部、連接鍵和疏水尾部[1]，其介導核酸（本文以質粒DNA 為例）進入細胞的過程主要分為以下三步：1）陽離子脂質體帶正電荷的頭部與帶負電荷的質粒DNA 通過靜電作用結合，形成脂質體-DNA 復合物[2]。其中質粒DNA 因被包裹在復合物內部而受到保護，其所帶負電荷被屏蔽，而陽離子分布在復合物表面，故所形成的復合物表面帶正電荷[3]。2）表面帶正電荷的陽離子脂質體-DNA 復合物通過靜電作用吸附于表面帶負電荷的細胞膜表面[3]，繼之復合物被內吞進入細胞質內。隨后DNA 被釋放至細胞質內[4]。3）極少一部分被釋放的DNA 可進入細胞核，得以轉錄表達[4-5]。基于上述陽離子脂質體介導核酸進入細胞的過程，本文從六個方面對某些學者及筆者自身優化轉染條件的經驗加以總結。

1 靶細胞的類型、狀態及密度

靶細胞的類型不同，應用同種轉染方法進行轉染的效率也會有所不同[4]。轉染貼壁細胞時，細胞應處于單層、生長旺盛的對數生長期。細胞傳代次數不宜過多，一般復蘇后傳至第2 或第3代即應進行轉染；復蘇但尚未傳代的細胞，一般不應使用，轉染效率會很低。另外，轉染時細胞的融合度一般以60% ～85% 為宜。

2 陽離子脂質體與核酸的比例

為提高轉染效率，陽離子脂質體與核酸的比例應盡可能符合最佳電荷比[6-7]。陽離子脂質體與質粒DNA 的電荷比越高，毒性越強[8]。若質粒DNA 的用量過多，將造成陽離子脂質體結構不穩定，或質粒DNA 在所形成的脂質體-DNA 復合物中不能很好地被包裹和保護，或產生過強的毒性，從而導致轉染效率低下[5,9]；在陽離子脂質體的濃度超過一定范圍后，濃度越高，毒性也將越強，轉染效率也將大幅度下降。

3 核酸的純度

鹽離子、蛋白、多糖和內毒素存在于質粒DNA 溶液中均會影響脂質體-DNA 復合物的形成效率，并會帶給細胞較強的毒性，進而影響轉染效率，降低細胞存活率[10]。故制備質粒時，應盡可能提高純度。

4 時間

若想確保轉染成功，需要注意優化以下時間：1）陽離子脂質體- 質粒DNA 復合物形成時間。若上述形成時間過短，將影響轉染效率[8]。2）轉染時的孵育時間。在一定的時間范圍內，轉染效率會隨孵育時間的延長而升高。若孵育時間過短，脂質體-DNA 復合物尚未充分通過細胞膜，轉染效率將會很低；若孵育時間過長，脂質體、質粒DNA 或其中所混有的某些物質就會對細胞造成毒性，從而影響轉染效率。3）檢測轉染是否成功的時間。若檢測時間過早，轉染的核酸可能尚未表達或表達量過小（進入胞漿中的質粒DNA，其僅約有1/1000 的幾率能進入細胞核[5]）。

5 血清

在應用某些陽離子脂質體轉染試劑（例如Lipofectamine）進行轉染實驗的過程中，血清的存在會降低稀釋脂質體或質粒DNA、脂質體-DNA 復合物形成及轉染時孵育的效率[11-12]。

6 抗生素

在培養細胞的過程中，為防止污染，常會添加抗生素。但抗生素的存在有時也會降低轉染效率。有學者指出，應用Lipofectamine 等轉染試劑進行轉染實驗的過程中，在轉染前細胞鋪板時、稀釋轉染試劑或質粒DNA 時及進行轉染孵育時，均應盡量避免使用抗生素。

7 結語

總之，為了獲得良好的轉染效率，需要綜合考慮各種可能影響轉染效率的因素并加以優化。當然，嚴格的無菌操作是成功轉染所必不可少的先決條件。