Pif1維持基因組穩定性在腫瘤中發揮的作用

陳波，李志杰

（中國醫科大學附屬盛京醫院醫學研究中心，遼寧省環境與代謝疾病動物模型研究與應用重點實驗室，沈陽 110004）

解旋酶是生物體內核酸代謝中必不可少的酶，能將遺傳物質傳遞給后代［1］。解旋酶被稱為分子運動蛋白，沿著DNA磷酸二酯主鏈單向轉移，利用核苷三磷酸（nucleoside triphosphate，NTP）水解的能量將穩定的DNA雙鏈分離成單鏈或改造核酸蛋白復合物［2］。解旋酶參與多種細胞功能的調控，與肝癌、乳腺癌和卵巢癌等腫瘤的發生發展密切相關［3-5］。

基于解旋酶序列的保守性，可分為6個不同的超家族（superfamily 1-6，Sf1-Sf6）。根據在核酸中移位的方向性，這些家族又被分為A（典型代表為PcrA和Srs2）和B（典型代表為RecD2和Pif1）2組［6］。Pif1屬于超家族ⅠB解旋酶，在核酸上沿5’-3’方向轉位［6］。文獻［7］報道，Pif1可抑制DNA損傷，防止G4四鏈體的復制停頓和雙鏈斷裂（double strand breaks，DSBs），并通過調節端粒酶在DSBs上的作用抑制總染色體重排（gross chromosomal rearrangement，GCR），提示Pif1在維持基因組穩定性方面具有不可或缺的作用。本文對Pif1在DSBs修復相關DNA復制中發揮的作用進行綜述，利于對Pif1在維持基因組完整性上所發揮作用的理解。

1 Pif1與基因組穩定性

Pif1在不同生物體中有單個或多個亞族。目前，已知釀酒酵母基因組編碼2個Pif1同源基因（Pif1和Rrm3），裂殖酵母、小鼠和人類基因組只編碼1個Pif1同源基因（分別為Pfh1，mPif1和hPif1）［8］。作為DNA解旋酶家族中的典型成員，Pif1在線粒體基因組維護中發揮多種作用，包括線粒體基因組維持、端粒形成的抑制和岡崎片段處理等［2-9］。

1.1 線粒體基因組的維持

在正常細胞中，線粒體是主要細胞器，對內環境的調控至關重要。由線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變引起的功能障礙，與腫瘤的發生發展密切相關［10］。釀酒酵母Pif1最初在基因篩檢中分離出，其突變會影響線粒體基因組的重組頻率［11］。Rrm3基因編碼另外5’-3’方向的DNA解旋酶，最初是因其在核糖體DNA（ribosomal DNA，rDNA）中引起重組升高而被識別，后經蛋白質組分析也發現其位于線粒體［12］。盡管Pif1和Rrm3在結構上相似，并通過作用于共同的靶點來促進基因組的完整性，但它們在線粒體中具有不重疊和甚至有時相反的作用［2-13］。

在Pif1缺乏的細胞中，mtDNA的重組減少，這提示Pif1對mtDNA復制和重組至關重要［14］。在Pif1突變體中，細胞對溴化乙錠（ethidium bromide，EtBr）誘導的DNA損傷敏感，mtDNA易碎裂并隨之丟失［15］。此外，在Pif1缺乏的細胞中，在特定位點發生mtDNA的斷裂，這意味著Pif1可以阻止或修復mtDNA中的DSBs［15］。研究［16］表明，下調Pif1基因可降低結腸癌細胞存活率，但對正常細胞沒有影響，這可能是由于其在重新啟動停滯的復制叉方面的作用。

1.2 端粒形成的抑制

Pif1作為從頭端粒形成和延伸的負調控因子，以檢測失去亞端粒基因表達的突變體。在Pif1缺失的情況下，端粒長度增加約75個堿基對［17］。Pif1蛋白的過量產生可恢復mtDNA重組能力，并適度縮短端粒長度［18］。Pif1的過表達導致CDC13-1和Ku缺陷菌株的活力降低，且該表型被EXO1的突變抑制，該突變編碼端粒降解外切核酸酶，表明Pif1去除端粒酶會降低端粒末端保護功能［19］。

在釀酒酵母中，DNA損傷會導致Pif1的磷酸化，從而阻斷DSBs端粒酶的活性，但不會阻斷染色體末端的活性［20］。Pif1和Rrm3由不同的框架翻譯起始密碼子表達，與Pif1突變體表現出的端粒酶活性依賴的高GCR率不同，Rrm3基因突變既不影響GCR率，也不影響從頭端粒的添加［21］。然而，Rrm3在體內仍然與端粒相關，并在端粒DNA的及時復制中發揮重要作用，影響端粒的長度［21］。hPif1的氨基酸序列與釀酒酵母Pif1和Rrm3具有同源性［22］，在體內外，與端粒酶的催化亞基hTERT相互作用，并在過表達時縮短端粒長度，這表明其在功能上與釀酒酵母Pif1具有相似性。

1.3 岡崎片段的成熟

基于雙鏈體DNA的反向平行結構，當前導鏈不斷向復制叉延伸時，后隨鏈DNA復制是一系列連續的過程，這些過程連接形成岡崎片段［23］。在釀酒酵母中，DNA聚合酶δ（DNA polymerase δ，Polδ）在每個細胞周期內產生約十萬個岡崎片段，且每個片段都需要以高保真度連接到DNA鏈中，以避免未修復缺口的積累導致DSBs和細胞致死性［24］。

通過對裂殖酵母的研究，發現Pif1在岡崎片段的加工中起重要作用。其中，對溫度敏感的Cdc24等位基因被Pfh1+（釀酒酵母的同系物）內的突變體抑制，而Pif1和Dna2-C2突變體對溫度敏感的生長缺陷被Pfh1-R20（Pfh1的冷敏感突變體等位基因）抑制［25］。在釀酒酵母中觀察到了類似的作用，Pif1突變體在30 ℃時抑制了Dna2突變體的致死表型，但在更高的溫度下卻沒有［26］。即使在37 ℃時，Pif1-Dna2雙重突變體仍然存在，但DNA聚合酶32（DNA polymerase 32，Pol32）會額外缺失，而Pol32缺失編碼Polδ的非必需亞基，提示Pif1和Pol32通過持續性刺激有助于下游岡崎片段的置換和更長的鏈瓣產生Polδ［6］。綜上，在后隨鏈合成過程中，Pif1和Pol32產生了需要Dna2活性才能完成DNA復制的中間底物，有利于岡崎片段的形成。

1.4 DNA合成的修復

在裂殖酵母中，Pfh1不僅需要完成DNA復制，還需要對DNA破壞劑作出反應。對冷敏感的Pfh1-R20突變細胞在特定溫度下對甲磺酸甲酯（methyl methanesulfonate，MMS）和羥基脲（hydroxyurea，HU）高度敏感，表明其在DNA損傷修復中的作用［27］。在釀酒酵母中，與裂殖酵母Pfh1突變體相比，Pif1突變體對MMS和HU僅有中等敏感性。然而，Pif1在γ射線照射后與Rad52（同源重組蛋白）共定位在核內，從而修復了病灶，表明Pif1對DSB的修復和重組具有特異性作用［28］。據文獻［29］報道，Pif1在通過斷裂誘導復制（break-induced replication，BIR）途徑產生DSB修復產物中具有重要作用。

2 Pif1與腫瘤的調控

基因組不穩定性突變被認為是癌癥發生和發展的重要誘因，而線粒體基因組維持、端粒形成的抑制和岡崎片段處理等對維持基因組的穩定性至關重要。解旋酶被證明在保護細胞免受DNA損傷中起關鍵作用。與Pif1在維持復制叉完整性中的作用相一致，腫瘤細胞中Pif1的消耗可以防止從胸苷誘導的復制停滯釋放后進入S期并減慢S期進程［30］。研究［16］指出，Pif1具有在S期進入和在新的復制位點上觸發起點的作用，為維持基因組穩定性所必需。當新的復制位點對起始點激發的需求增加時，尤其是在致癌基因誘導的復制應激期間，這可能變得至關重要。據文獻［31］報道，致癌基因的活化和進入S期的失控可能導致腫瘤細胞出現慢性DNA復制應激。在這種情況下，腫瘤細胞表現出對Pif1的依賴性增加，以維持生存能力。研究［32］表明，細胞中Pfh1-L430P等位基因的表達導致細胞核和線粒體功能的喪失，而該變異體無法補充Pfh1在細胞核和線粒體中的基本功能，從而增加了乳腺癌的患病風險。

Pif1可以負調控端粒酶，促進岡崎片段的處理。當細胞內Pif1缺乏或失調時，岡崎片段的成熟受到抑制，加大了正常細胞向腫瘤轉變的可能性。據文獻［33］報道，Pif1能夠抑制DNA末端的端粒酶活性，端粒長度穩態對維持基因組穩定至關重要，端粒酶的激活和抑制是治療人類疾病的潛在療法。Pif1被證明在DSB修復中起關鍵作用，其中，BIR是主要的修復途徑，而Pif1可以通過控制核酸酶活性在端粒上啟動DDR［34］。此外，必需的端粒“帽”蛋白通過抑制DNA損傷反應和調節端粒酶募集，將端粒與DSB區別開來，從而發揮抗癌的作用［35］。

3 總結

Pif1是一類高保守的解旋酶，涉及各類核酸的處理。盡管Pif1在酵母細胞中具有作為全能DNA代謝參與者的多功能性，但與裂殖酵母或更高等的真核生物中其直系同源物的作用不一致。mPif1缺失突變幾乎沒有可見的表型，包括端粒長度未出現改變。雖然hPif1的功能有很多未知，但保守的Pif1殘基的突變與乳腺癌易感性增加有關，這表明hPif1可能起到抑癌作用。即使釀酒酵母Pif1和Rrm3，以及hPif1表達定位于裂殖酵母的線粒體和細胞核中，這些同源物都不能提供Pif1的所有基本功能。

Pif1解旋酶家族的每個成員都具有自己獨特的活性，這是由于其結構、寡聚狀態和底物選擇等方面的決定性差異。鑒于Pif1解旋酶家族在細胞中廣泛的獨特功能，隨著對Pif1解旋酶家族進行更全面而深入的研究，將揭示Pif1在人類相關腫瘤疾病中所發揮作用的更多細節，也為抗癌新藥的設計等提供新的靶點和思路。