院內深部真菌感染的流行病學研究進展

鄧斌

安順市人民醫院 貴州 安順 561000

在院內感染的研究中，一個很重要的問題，就是如何確定感染源和傳播途徑只有明確病原菌的感染方式，才能采取有效的預防和控制措施，因而對微生物的鑒定和分類就不能僅限于種間水平，還必須深入到種內即亞種，以便更精確了解其流行病學意義。以往真菌的分型方法主要嵌賴于血清型、酵母殺菌系統，抗性譜。等生物學方法，但這些方法易受環境及人為因素的影響而缺乏滿意的穩定性和重復性。另外，生物學方法也不能精細分型，分辨率低，影響了其流行病學及致病力的研究。近年來，分子生物學技術已廣泛應用于細菌病毒基因水平的研究。目前已有一些分子生物學技術的方法如限制性內切酶多態性分析(RFLP)、脈沖場電泳核型分析(PFGE)、基因探針雜交分析(SHA)及隨機引物擴增DNA—PCR多態性分析(RAPD)等應用于真菌研究，尤其是念珠菌基因分型的研究[1-4]。這些方法與生物學分型方法相比，具有良好的穩定性，重復性及高分辨率，現將其有關研究動態綜述如下。

1.DNA基因分型對于流行病學研究具有重要的指導意義

無論采用何種分型方法，都必須有明確的調查目的，即(1)確定爆發流行；(2)確定傳播途徑，評價預防措施；(3)監測某些有害致病菌。這些分型方法的基本原理是，相同的菌株具有相同的DNA指紋圖譜，而不同菌種，其DNA指紋圖譜也不同如果病人自身不同時期或不同解剖部位分離出相同的基因型菌株，且病人之間的基因型不同，多屬于內源性感染。定植株與感染株基因型相同，且定植株先于感染株，也提示為內源性感染。如果從不同病人身上、工作人員及環境中同時分離出相同的基因型菌株，則多為交叉感染。而這些結論都必須依靠良好穩定性、重復性及高分辨率的分型方法[5-7]。

2.常用的幾種分型方法

限制性內切酶多態性分析(RFLP)：就是對DNA分子用不同的內切酶處理后，通過瓊脂糖電泳所產生的DNA片段的大小進行分析，便可推論出所用酶在該DNA分子中的切點數目以及它們的位置關系，了解菌種在基因水平上的相同或不同，從本質上區別種問差異用限制性內切酶分析產生的基因多態性稱為RFLP1987年Scherer等首先將這種方法用于念珠菌的研究。用EcoRl對6株白色念株菌DNA進行酶切分析，可見到許多條帶(>100)，最明顯的帶型有3條對同一株菌反復酶切分析，帶型不發生改變，證明其具有良好的重復性。又將同一株菌大約傳代420次后酶切分析，傳代前后具有相同的酶切圖譜，顯示了良好的穩定性預測該方法在研究真菌感染方面將具有廣闊的應用前景。目前用于真菌研究的限制性內切酶已選20余種，常用的有EcnRJ、Mspl、Hindi、BanHI等。EcoRI價格低，來源方便，是一種最常用的酶，其對白色念珠菌酶切可產生4～16個基因型。Vazqauez等采用EcoRI和Mspl對白色念珠菌進行酶切。EcoRI酶切產生6個基因型，MspI產生6個基因型，兩種酶聯合分型為17個基因型，說明聯合酶切可提高分辨率。Delabesse等比較了RFLP和PFGE兩種方法，Rea—gan等比較了RFLP和SHA兩種分型方法對相同菌株的分型圖譜，認為RFLP分別比電泳核型(EK)、SHA所產生的基因型多，分辨率高，更能精細區別不同來源的菌株。RFLP不需要特殊的實驗儀器，一般實驗室條件即可完成。但RFLP需提取大量完整的DNA，同時，電泳帶型易受DNA提取過程、電泳條件的影響，是其固有的缺點[8-12]。

脈沖場電泳核型分析(PFGE)：這也是常甩的分型方法。一般情況下，普通瓊脂糖凝腔電泳只能分離50kb以下的DNA片段，且它是單方向電場，較大的DNA分子容易陷在凝膠孔里而停滯，而PFGE至少有兩個方向的電場，在設定的時間內交替變換，使大分子DNA在行進中不斷改變tl己的形態及遷移方向，從而繞過細小的凝膠孔隙得以分離。PFGE可分析2Mb以上的DNA分子，用PFGE得到的全基因染色體組型稱為電泳核型(EK)對病原體而言，EK分析特別適用于基因組含若干條染色體的低等真核微生物或原蟲，它無需用限制性內切酶消化和探針雜交，就可方便地從EK的差異區別不同的菌種。念珠菌有4～10條染色體。EK分析帶型清晰易辨，容易比較，能夠區別種間差異，是一種較好的流行病學研究方法，但與其它方法相比，它需要較昂貴的儀器，DNA的制備及PFGE過程也均較費時[13-15]。

基因探針雜交分析(SHA)：目前用于真菌：尤其是念珠菌感染研究的基因探針.包括全染色體基因探針、線粒體基因探針、白色念珠菌肌動蛋白基因探針和白色念珠菌2.9kb、27A、C3a、pBD40特異性探針等。在菌種的鑒定上，基因探針敏感性及特異性高，帶型簡單易解釋，但在種間分型的應用上，不如RFLP和EK方法分辨率高。目前還沒有人工合成探針，且DNA抽提、酶切、片段標記等制備過程繁瑣，不適用于臨床上大量標本的流行病學調查[16-19]。

隨著PCR技術的廣泛應用，隨機引物擴增PCR多態性分析(RAPD)是近年來發展起來的一種新的種間分型方法。通過選擇單條或多條片段長度為8～10個堿基寡核苷酸引物，用PCR的方法對標本底物擴增，經瓊脂糖電泳分離出不同長度的片段構成PCR指紋圖譜。Belkum對白色念珠菌的RAPD、EK、EcoRI和HindI酶切的RFIP、27A探針的基因圖譜進行比較分析顯示，RAPD能分辨13個基因型，而其它方法分別產生8～12個基因型，因而認為RAPD具有較高的分辨率。RAPD最明顯的優點是不需要抽提大量的DNA，從臨床標本中可直接檢測，并可同時進行種間鑒定和種內分型，而其它方法則需要在鑒定出種屬的基礎上再分型，所以RAPD更快速、簡便，是一種具有發展前途的種間分型方法[20-23]。

3.分子生物學技術在真菌流行病學調查方面的應用

Pitter等用EK法研究了致病酵母菌在危重病人寄生的縱向和橫向模式。他們在6個月內前瞻性地從29例危重病人身上分離出322株念珠菌，這些菌株分離自多個解剖部位不同時期的同一部位，每一病人分離出的菌株具有同一種EK型，即使取自不同部位或經過一段時間(長達140天)也是如此，其中8例患者發生真菌菌血癥，其定植株與感染株的EK型相同.且定植先于感染Reagan等對骨髓移植和血液病患者進行調查，對16例念珠菌感染病人的分離株進行分析，其中15例病人定植株與感染株有相同的基因型，而10／13(81)病人之間具有不同的基因型。以上研究資料證明危重病人真菌感染多由內源性感染引起.感染源來自病人自身定植菌株[24]。

雖然許多院內念珠菌感染是由內源性感染引起，但真菌外源性感染也是不可忽視的問題。Sanchez等“對一所醫院重點監護室(ICU)病區和骨髓移植病區的89例患者進行了前瞻性調查，5例病人發生近平滑念珠菌感染，這5例病人入院時均無近平滑念珠菌定植。分別從4名工作人員的手及環境中分離出該致病菌。用RFLP分析表明，4例病人、3名工作人員及環境中具有該菌相同的基因型，說明近平滑念珠菌感染是由間接接觸傳播的。Girardin等對2例侵襲性曲霉菌感染病人分離株及環境中分離株用Southern斑點印跡雜交分析顯示.病人感染與空氣污染有關，空氣傳播可能是曲霉菌感染的傳播方式。Voss和Romano等分別對兩起外科ICU病區念珠菌爆發感染進行調查.從病人不同感染部位、病人使用物品、工作人員手和咽部分離出白色念珠菌。用RFLP分型分析，認為爆發流行是因間接接觸引起的交叉感染，工作人員的手是傳播媒介，提示洗手是預防真菌交叉感染必不可少的措施[25-26]。

對某些特定真菌進行基因水平分型是流行病學研究的重要工具.它將對真菌感染的預防和控制具有重大指導意義。今后的研究方向應對分型方法統一實驗條件和操作方法，并建立統一的分型標準。