丹參酮IIA對膿毒癥肺損傷大鼠氧化應激的影響

黃約諾 葉威 鄭青秀 潘錕鐳 李獻超 王世強 劉剛

膿毒癥（Sepsis）是全身嚴重的炎癥反應，隨著疾病的發生發展，可造成許多器官的功能衰竭。每年全世界約14,000人因膿毒癥而喪失生命。目前，由于膿毒癥的發生發展機制并不清晰，因此其已發展成為臨床診治的一大難題。有研究表明，在眾多并發癥中，肺損傷是最早出現的且最為嚴重的［1］，同時其也是“高死亡率”的重要原因之一，死亡率達50%~70%［2］。有學者認為膿毒癥所導致的肺損傷是由于氧化應激產生了大量的有害自由基，引起蛋白質結構被破壞，最終導致死亡率高、預后差［3］。而蛋白質變性后，肺組織分泌更多的血管活性物，肺毛細血管擴張，分泌的血管活性物質滲透到肺泡、肺間質，導致組織損傷、肺水腫［4］。近年來，隨著分子生物研究發展，復方中藥、中藥單體被驗證具有顯著的療效，對臨床有一定的指導意義［5］。丹參酮IIA（TanshinoneⅡA，TanⅡA）是一種黃酮類化合物，屬于近幾年熱門研究的中藥單體—丹參的脂溶性成分，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基的作用，并且因其在肺臟中的濃度最高，受到研究者的注意［6］。本研究基于動物模型—膿毒癥肺損傷大鼠，探討熱門中藥單體—丹參酮IIA對膿毒癥大鼠肺損傷時的機制及影響程度，為今后的臨床診治提供新的思路與理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 于上海斯萊克公司采購共50只SPF級健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質量220~250 g（動物合格證號：SYXK（浙）2021-0012），動物實驗開展前1周，于浙江中醫藥大學動物中心常規飼養，所有動物采用白晝交替光照，保證正常的光照、溫度、濕度、飲食。

1.2 實驗藥物與試劑 丹參酮IIA磺酸鈉注射液（Aladdin，S107694）；黃嘌呤氧化酶試劑盒（酶聯生物公司，ML654721）、丙二醛試劑盒（酶聯生物公司，ML077384）、谷胱甘肽過氧物酶試劑盒（酶聯生物公司，ML097316）、超氧化物歧化酶試劑盒（酶聯生物公司，ML059387）。

1.3 實驗分組及模型制備 50只SD大鼠編號，隨機分成5組，每組各10只。假手術組：開腹翻動腸道，關腹，2 h后腹腔注射0.9%氯化鈉溶液（20 mL/kg），24 h后麻醉并腹主動脈采血，直至大鼠缺血而死。模型組：經典造模方案——盲腸結扎穿孔法（CLP），評估造模成功后2 h后，每只大鼠采用腹腔注射方式，注射0.9%氯化鈉溶液（20 mL/kg），然后，觀察大鼠一般情況，并于24 h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，評估麻醉成功后，于大鼠腹主動脈穿刺采集動脈血，大鼠最終因缺血宣布死亡。治療組分3個組，即低劑量治療組（丹參酮IIA 5 mg/kg）、中劑量治療組（丹參酮IIA 10 mg/kg）、高劑量組（丹參酮IIA 20 mg/kg）：同樣采用CLP術，2 h后分別腹腔注射丹參酮IIA（5、10、20 mg/kg），24 h后，將大鼠腹腔麻醉，采血針行腹主動脈采血，直至大鼠因缺血而死亡。

1.4 大鼠動脈血氣分析 24 h后，采集大鼠腹主動脈血，行血氣分析，計算動脈血氧合指數（PaO2/FiO2）。

1.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測大鼠左肺下葉肺組織中炎癥、氧化因子含量 打開大鼠胸腔，剪下心肺，快速分離，用勻漿機將大鼠左肺下葉制備成肺組織勻漿，2,000 r/min，離心1 min，吸取上清液，嚴格按照實驗試劑盒說明書，ELISA法檢測肺組織勻漿標本中XO、GSH-Px、MDA、SOD含量。

1.6 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料符合正態分布以（）表示，進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠動脈血氣分析結果 與假手術組比較，模型組、低劑量治療組（丹參酮IIA 5 mg/kg）、中劑量治療組（丹參酮IIA 10 mg/kg）中氧合指數（PaO2/FiO2）結果都明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），高劑量組（丹參酮IIA 20 mg/kg）與假手術組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，3個不同劑量的治療組中的氧合指數（PaO2/FiO2）結果都升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同組大鼠動脈血氣PaO2/FiO2結果（）

表1 不同組大鼠動脈血氣PaO2/FiO2結果（）

組別 只數 氧合指數（PaO2/FiO2） 與假手術組比 與模型組比假手術組 10 453.2±18.1模型組 10 303.1±8.9 ＜0.0001丹參酮IIA低劑量組 10 366.0±13.5 ＜0.0001 ＜0.0001丹參酮IIA中劑量組 10 383.7±17.1 ＜0.0001 ＜0.0001丹參酮IIA高劑量組 10 435.3±22.7 0.076 ＜0.0001 F值 373.856 P值 ＜0.001

2.2 丹參酮IIA對不同組左肺下葉肺組織炎癥、氧化因子水平的影響 與假手術組比較，模型組及低、中劑量治療組，XO、MDA含量升高，SOD、GSH-Px降低，差異有統計學意義（P＜0.05），高劑量治療組與假手術組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，三種劑量的治療組中的XO、MDA均下降，SOD含量升高，有顯著性差異（P＜0.05），然而在實驗研究中發現，GSH-Px結果比較中發現高劑量組GSH-Px含量與模型組對比，有顯著性差異（P＜0.05），低劑量組和中劑量組與模型組對比，差異無統計學意義，（P＞0.05）。見表2-6。

表2 不同組大鼠肺組織中XO、MDA、SOD、GSH-Px結果（）

表2 不同組大鼠肺組織中XO、MDA、SOD、GSH-Px結果（）

注：XO=黃嘌呤氧化酶；MDA=丙二醛；SOD=超氧化物歧化酶；GSH-Px=谷胱甘肽過氧化物酶；與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 只數 XO（U/g） MDA（nmol/mg） SOD（U/mg） GSH-Px（U/mg）假手術組 10 2.5±0.3 16.5±2.5 56.2±8.1 32.2±5.2模型組 10 5.8±0.6* 42.4±6.6* 37.8±7.6* 25.3±3.9*丹參酮IIA低劑量組 10 4.2±1.5*△ 27.4±8.3*△ 44.3±12.3*△ 26.3±1.7*丹參酮IIA中劑量組 10 3.1±0.6*△ 24.2±8.5*△ 46.8±5.1*△ 26.9±3.9*丹參酮IIA高劑量組 10 2.4±0.8△ 17.2±7.1△ 55.4±8.3△ 29.9±3.8△F值 99.329 9.345 26.971 7.907 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 不同組大鼠肺組織中XO結果分析及對比（）

表3 不同組大鼠肺組織中XO結果分析及對比（）

組別 只數 XO（U/g） 與假手術組比 與模型組比假手術組 10 2.5±0.3模型組 10 5.8±0.6 ＜0.001丹參酮IIA低劑量組 10 4.2±1.5 ＜0.001 ＜0.001丹參酮IIA中劑量組 10 3.1±0.6 0.01 ＜0.001丹參酮IIA高劑量組 10 2.4±0.8 0.516 ＜0.001

表4 不同組大鼠肺組織中MDA結果分析及對比（）

表4 不同組大鼠肺組織中MDA結果分析及對比（）

組別 只數 MDA（nmol/mg） 與假手術組比 與模型組比假手術組 10 16.5±2.5模型組 10 42.4±6.6 ＜0.001丹參酮IIA低劑量組 10 27.4±8.3 ＜0.001 0.020丹參酮IIA中劑量組 10 24.2±8.5 0.006 0.010丹參酮IIA高劑量組 10 17.2±7.1 0.648 ＜0.001

表5 不同組大鼠肺組織中SOD結果分析及對比（）

表5 不同組大鼠肺組織中SOD結果分析及對比（）

組別 只數 SOD（U/mg） 與假手術組比 與模型組比假手術組 10 56.2±8.1模型組 10 37.8±7.6 ＜0.001丹參酮IIA低劑量組 10 44.3±12.3 ＜0.001 ＜0.001丹參酮IIA中劑量組 10 46.8±5.1 ＜0.001 ＜0.001丹參酮IIA高劑量組 10 55.4±8.3 0.279 ＜0.001

表6 不同組大鼠肺組織中GSH-Px結果分析及對比（）

表6 不同組大鼠肺組織中GSH-Px結果分析及對比（）

組別 只數 GSH-Px（U/mg） 與假手術組比 與模型組比假手術組 10 32.2±5.2模型組 10 25.3±3.9 ＜0.001丹參酮IIA低劑量組 10 26.3±1.7 ＜0.001 0.863丹參酮IIA中劑量組 10 26.9±3.9 0.01 0.451丹參酮IIA高劑量組 10 29.9±3.8 0.616 ＜0.001

3 討論

膿毒癥是全身炎癥反應，當機體出現難以控制的嚴重感染時，伴多個器官功能障礙時，則病情惡化快，預后差，死亡率高。隨著病情的發生發展，患者呼吸困難，血氣分析示難以糾正的低氧血癥，表明肺臟是最早且最容易出現器官功能障礙，即ALI/ARDS，電鏡下病理表現為肺間質充血、水腫［7］。盡管，在臨床上，膿毒癥患者已在重癥監護室嚴密監測，予抗感染、休克等對癥處理，但疾病病死率仍高、預后差，因此，重點著眼于中醫藥干預膿毒癥所引起的肺損傷，并探討中藥的作用機制，探索干預方案，為臨床診治提供新的思路。在膿毒癥肺損傷的發生發展機制中，有學者認為氧化應激反應起了重要的作用，導致死亡率高、預后差。SHI等人認為，氧化應激可能引起內皮和上皮屏障功能障礙，使大量中性粒細胞通過屏障，分泌細胞毒素，導致組織損傷、肺水腫［8］。楊麗夢等認為，其機制即為氧化與抗氧化失去平衡，當機體處于全身炎癥以及氧化應激狀態時，產生有害氧自由基，降低細胞的抗氧化活性，使得脂質過氧化增多，炎癥因子大量產生，最終導致肺間質水腫。因此抗氧化治療可能是一條有效的治療路徑［9］。

黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）［10］、丙二醛（malondialdehyde，MDA）［11］、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）［12］與谷胱甘肽過氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）［13］均和氧化應激存在著密切的聯系。而本研究通過檢測XO、MDA、SOD及GSH-Px的水平，發現丹參酮ⅡA具有通過抗氧化緩解膿毒癥肺損傷的能力。

《中國藥典》中記載中藥丹參（Salvia miltiorrhiza）的功效為祛瘀止痛、活血通經及清心除煩。目前丹參已廣泛應用于心血管疾病、腸道疾病、神經系統疾病以及過敏性疾病的臨床治療中，而它改善疾病的機制可能與抗炎、抗氧化和清除自由基、改善能量代謝、抗腫瘤、擴張血管等相關［14］。丹參酮IIA（TanshinonellA，TanllA）是一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化和清除自由基的作用。丹參酮IIA已經證實可以通過抗炎、抗腫瘤、清除氧自由基從而減輕大鼠肺纖維化［15］。陶靜等發現丹參酮ⅡA可以通過減少炎癥因子與減輕組織損傷從而緩解膿毒癥心肌損傷［16］。王志敏等在慢阻肺大鼠模型中發現丹參酮IIA通過抗炎改善肺功能［17］。李俊峰等發現丹參酮IIA具有抗炎平喘、改善哮喘氣道功能［18］。

在本研究中，采用CLP所引起的膿毒癥大鼠模型。通過給予CLP大鼠丹參酮ⅡA后，CLP大鼠PaO2/FiO2升高，XO、MDA水平降低，SOD、GSH-Px水平升高。因此丹參酮ⅡA改善膿毒癥肺損傷可能與抗氧化應激相關，這些研究為膿毒癥肺損傷的治療提供了新的方向。