熊果酸和坡膜酸通過上調烏頭酸脫羧酶1 表達促進巨噬細胞內毒素耐受作用的研究

李 玲，譚 洋，汪 濤，張 熙，肖錦仁，李志忠*，裴 剛*

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南省普通高等學校中藥現代化重點實驗室，湖南 長沙 410208；3.湖南省第二人民醫院，湖南 長沙 410021；4.古漢中藥有限公司，湖南 衡陽 421000）

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，廣泛分布在身體的各個組織中。 在不同的病理條件下，巨噬細胞可極化為促炎的M1 型巨噬細胞（經典活化的巨噬細胞）和抗炎的M2 型巨噬細胞（替代活化的巨噬細胞）[1]。 抑制巨噬細胞炎癥因子表達、促進抗炎細胞因子的分泌，能很好地抑制機體炎癥反應，對炎癥相關的多種疾病起到良好的治療作用。

內毒素耐受是指先天免疫細胞（如單核細胞和巨噬細胞）在內毒素[如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）]長期刺激后，再次接受同類刺激時，細胞炎癥反應受到抑制的現象[2]。 內毒素耐受現象存在于多種炎癥相關疾病中[3]，被認為是機體受到長期炎癥損傷的保護機制。 促進內毒素耐受，能夠抑制炎癥細胞引發的炎癥損傷，對膿毒癥等多種炎癥疾病起到一定的治療作用。

烏頭酸脫羧酶1（aconitate decarboxylase 1, IRG1）是炎癥和感染中免疫代謝的調節因子，在炎癥反應、抗菌過程、腫瘤、神經退行性改變等病理狀態下，均發現IRG1 的表達上調[4-6]。 巨噬細胞在病原體相關分子模式（如LPS）、細胞因子（如TNF-α 和IFN-γ）等的刺激下高表達IRG1[7]。 研究表明，IRG1 可以通過催化衣康酸在巨噬細胞中的積累，抑制LPS 刺激所導致的氧化應激促進細胞的抗炎表型[8]。 此外，IRG1 催化產生的衣康酸，可抑制琥珀酸脫氫酶的活性，增加琥珀酸的積累，這在巨噬細胞代謝重塑中發揮著重要作用[9]。 但是，尚未有關IRG1 對內毒素耐受作用的相關研究報道。

熊果酸（ursolic acid, UA）和坡膜酸（pomolic acid,PA）均屬于烏蘇烷型五環三萜，有多篇文獻報道了這兩個化合物在抑制巨噬細胞炎癥反應方面的活性[10-11]。本研究旨在通過體外實驗研究IRG1 對巨噬細胞內毒素耐受的調控，及UA 和PA 的干預作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

實驗所用小鼠RAW264.7 單核-巨噬細胞系（191220）購自中國科學院細胞庫。RAW264.7 單核-巨噬細胞，接種至含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 高糖培養基中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，實驗所用細胞均為處于對數生長期的傳代在2～10 代范圍內的細胞。

1.2 藥物及試劑

DMEM 高糖培養基（批號：C11995500BT）、胎牛血清（FBS,批號：10270106），購自美國Gibco 公司；小鼠TNF-α（批號：EK282P）、IL-6（批號：EK282P）ELISA 檢測試劑盒， 購自杭州聯科生物技術有限公司；LPS（批號：L2880），購自美國Sigma 公司；IRG1檢測抗體Anti-IRG1 antibody（批號：ab222411），購自美國Abcam 公司；β-actin 檢測抗體Anti-beta actin antibody（批號：AF018），購自美國Affinity Biosciences 公司；IRG1 過表達質粒（批號：214157），購自北京simo biological 公司；UA 和PA 均為本實驗室從福建野鴉椿果中制備[12]。

1.3 巨噬細胞內毒素耐受模型建立

參照文獻[13]中的方法，并加以改進建立巨噬細胞內毒素耐受模型，具體操作如下：將RAW264.7 細胞以1×106/孔的密度接種至6 孔板中， 以200 ng/mL濃度的LPS 干預細胞24 h，更換新鮮培養基，3 h后，再次以相同濃度的LPS 刺激細胞6 h，建立巨噬細胞內毒素耐受模型。

1.4 細胞上清液炎癥因子的檢測

于第1 次LPS 刺激6、24 h， 第2 次LPS 刺激3、6 h，收集上清液，3000 r/min 離心10 min，通過ELISA 試劑盒檢測其中IL-6 和TNF-α 的含量。

1.5 IRG1 蛋白表達檢測

在第2 次LPS 刺激6 h 后，用細胞刮刀刮下細胞，置于1.5 mL 離心管中，冰上裂解30 min。 4 ℃、1300 g 離心15 min，取上清蛋白溶液，以BCA 定量后105 ℃金屬浴變性10 min，通過Western blot 檢測樣本中IRG1 蛋白的含量。

1.6 IRG1 過表達巨噬細胞體系的構建

構建IRG1 過表達質粒，取其中100 μg 溶于100 μL無菌蒸餾水中，配制成濃度為1 μg/μL 的質粒儲備液。移取質粒4 μL（4 μg）加入71 μL Opti-mem 培養基，混勻，靜置5 min。移取Lipofectamine 2000 轉染試劑4 μL，加入71 μL Opti-mem 培養基，混勻，靜置5 min。 混合質粒及轉染試劑，混勻，室溫孵育25 min。 取出細胞密度為50%～60%的6 孔板，棄去培養基，加入適量無菌PBS 潤洗2 遍。吸盡PBS 后，于轉染孔中加入上述質粒與轉染試劑的混合液，再加入600 μL Opti-mem 培養基，輕輕混勻。 其余各孔中加入750 μL Opti-mem 培養基作為對照。轉染6 h 后更換新鮮DMEM 高糖培養基培養10 h。通過Western blot 檢測細胞中IRG1 蛋白的含量明確IRG1 過表達的效率。

1.7 IRG1 過表達對巨噬細胞內毒素耐受的影響

將巨噬細胞分為空白對照組、LPS 組、IRG1 過表達+LPS 實驗組。 參照“1.3”項條件進行巨噬細胞內毒素耐受的誘導，并于第一次LPS 刺激24 h 以及第二次LPS 刺激3、6 h 收集細胞上清液，通過ELISA 法檢測細胞上清液中炎癥因子的含量，在LPS 第二次干預6 h 檢測細胞中IRG1 蛋白的表達情況。

1.8 UA 和PA 對巨噬細胞內毒素耐受和IRG1 表達的影響

將巨噬細胞分為空白對照組、LPS 組、LPS+UA 5、10、20 μmol/L 組、LPS+PA 5、10、20 μmol/L 組。LPS 組參照“1.3 項”條件構建巨噬細胞內毒素耐受模型。 其余給藥組按照分組在造模開始時加入不同濃度的UA 和PA（5、10、20 μmol/L）進行干預，在LPS 和（或）藥物第一次干預24 h 以及第二次LPS刺激3、6 h 收集細胞上清液，通過ELISA 法檢測細胞上清液中IL-6 和TNF-α 的含量，在LPS 和（或）藥物第二次干預6 h 收集細胞，檢測其中IRG1 蛋白的表達情況。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 IRG1 過表達促進巨噬細胞內毒素耐受

與空白對照組相比，RAW264.7 巨噬細胞在LPS 第一次刺激時，炎癥因子IL-6 和TNF-α 分泌增加（P＜0.01）。與第一次LPS 刺激6 h 相比，第二次LPS 刺激6 h 時，IL-6 和TNF-α 的含量明顯低于第一次刺激（P＜0.01），表明巨噬細胞在第二次LPS 輪刺激時出現了內毒素耐受現象。 詳見圖1。

圖1 兩次LPS 刺激下巨噬細胞上清液IL-6（A）和TNF-α（B）的濃度

由圖2 可知，與空白組對照相比，在LPS 第二次刺激下(內毒素耐受階段)巨噬細胞IRG1 蛋白表達顯著上調，表明IRG1 過表達巨噬細胞構建成功。在LPS 第一次刺激6 h 和24 h 時，與相應時間點下的LPS 組相比，IRG1 過表達+LPS 組中IL-6 的分泌都明顯低于LPS 組（P＜0.01）；但IRG1 過表達+LPS組中TNF-α 的分泌與LPS 組相比，差異不明顯（P＞0.05）。 在LPS 第二次刺激3 h 和6 h 時，與對應時間點下的LPS 組相比，IRG1 過表達+LPS 組中IL-6和TNF-α 的分泌都明顯低于LPS 組（P＜0.01）。

圖2 IRG1 過表達對巨噬細胞炎癥因子釋放的影響

2.2 UA 和PA 促進巨噬細胞的內毒素耐受并上調IRG1 的表達水平

在LPS 第一次刺激巨噬細胞時（24 h），LPS+UA處理的各組間巨噬細胞TNF-α 的釋放均無統計學差異（P＞0.05）；在LPS 第一次刺激巨噬細胞時（3、6 h），與LPS 組相比，LPS+UA 濃度在10 μmol/L 和20 μmol/L時IL-6 的分泌降低（P＜0.05 或P＜0.01），LPS+PA 在10 μmol/L 和20 μmol/L 時TNF-α 的分泌降低（P＜0.05 或P＜0.01），LPS+PA 在5、10、20 μmol/L時細胞上清液中IL-6 的濃度均降低（P＜0.01）。 LPS 第二次刺激的3 h 和6 h 兩個時間點，LPS+UA 和LPS+PA在5、10、20 μmol/L 的濃度范圍內，巨噬細胞TNF-α和IL-6 的釋放均降低（P＜0.05 或P＜0.01）。詳見圖3。

圖3 UA 和PA 對巨噬細胞內毒素非耐受和耐受過程中炎癥因子釋放的影響

與空白對照組比較，LPS 組RAW264.7 細胞IRG1蛋白表達量增加(P＜0.01)；與LPS 組相比，LPS+UA和LPS+PA 在10 和20 μmol/L 的濃度范圍內RAW264.7細胞IRG1 蛋白的表達水平均上調（P＜0.01）。 詳見圖4。

圖4 UA 和PA 對LPS 刺激下巨噬細胞IRG1 蛋白表達的影響

3 討論

LPS 是革蘭氏陰性菌細胞膜上的重要組成成分，是造成革蘭氏陰性菌感染和炎癥反應的重要原因[14-15]。 LPS 能誘導巨噬細胞極化為M1 表型，誘導巨噬細胞IL-6、TNF-α 等炎性細胞因子的產生，進一步導致組織損傷和炎癥反應，因此，LPS 刺激巨噬細胞已被用作多種炎癥相關疾病的體外模型。然而，研究表明，長期處于LPS 刺激下，會誘導細胞處于內毒素耐受狀態。

內毒素耐受是機體和細胞調控自身免疫狀態和炎癥反應的一種生理機制。 免疫細胞長期處于LPS刺激下，會誘導細胞處于內毒素耐受狀態。 內毒素耐受作用也可被逆轉和促進， 比如巨噬細胞在LPS首次刺激前，加入IFN-γ 或GM-CSF 可防止內毒素耐受[16-17]；而在巨噬細胞接受LPS 第二次刺激前，加入H2O2，能夠促進巨噬細胞免疫耐受[18]。 研究發現，鱟抗內毒素因子模擬肽CLP-19 預處理巨噬細胞，可通過抑制內毒素耐受過程中IκBα 和IκBβ 的降解，降低LPS 誘導的巨噬細胞NF-κB 活性，起到促進內毒素耐受作用[19]。

IRG1 是炎癥和感染中免疫代謝的調節因子，參與了免疫細胞的抗炎、抗菌等生理功能。 在免疫細胞受到抗原侵襲時，細胞內IRG1 蛋白的表達水平會升高。 研究發現，IRG1 的表達與炎癥因子的產生呈負相關，并能夠抑制炎癥反應造成的組織損傷[20-21]。IRG1 抑制炎癥反應的機制近年來受到了極大的關注。 研究表明，IRG1 可以將順式烏頭酸轉化成衣康酸，進而修飾NLRP3，抑制炎癥小體的激活[22]。此外，IRG1 還可以通過抑制TLR 信號通路激活NF-κB，從而減少TNF-α 等炎癥因子的產生[23]。

IL-6 和TNF-α 均是由巨噬細胞受到LPS 等抗原刺激所產生的炎癥因子，在組織受到感染后會由免疫細胞大量產生并釋放到組織中。 作為一種調節機制，內毒素耐受可以避免這些炎癥因子無限制的產生，從而加重組織的損傷。 研究表明，在發生內毒素耐受時，巨噬細胞產生的IL-6 和TNF-α 均會出現顯著下調[24-25]。 為了研究IRG1 是否可以發揮促內毒素耐受的作用，本研究首先過表達IRG1，先后兩次加入LPS 刺激巨噬細胞，構建巨噬細胞內毒素耐受模型。 研究結果發現，IRG1 能抑制巨噬細胞在LPS 第二次刺激下，炎癥因子IL-6 和TNF-α 的分泌，表明IRG1 具有促進內毒素耐受的作用。

五環三萜具有廣泛的生物活性，多種五環三萜化合物具有免疫調節作用。 本研究在前期對部分五環三萜化合物促進巨噬細胞內毒素耐受的活性進行了篩選，從中得到了UA 和PA 兩個烏蘇烷型的五環三萜化合物，關于這類成分抑制巨噬細胞炎癥因子釋放的活性已經有著廣泛的研究和報道[26-27]。 本次研究發現烏蘇烷型三萜化合物具備有較好的促進巨噬細胞內毒素耐受的活性，這進一步豐富了該類成分對巨噬細胞調節作用的研究。 此外，UA 和PA均可上調免疫耐受階段巨噬細胞IRG1 蛋白的表達，表明調控IRG1 的表達可能是這兩個化合物促進免疫耐受的機制之一。 本次研究對于UA、PA 等五環三萜的生物活性的進一步認識、IRG1 配體的尋找及促內毒素耐受藥物的開發都有一定的意義。