基于TGF-β1/Smads 信號(hào)通路研究丹荔輸通湯對(duì)慢性輸卵管炎性阻塞模型大鼠的影響

喬 江，吳肖男，王 葉，劉 祎，陳智芬

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

輸卵管炎性阻塞性不孕癥（salpingitis obstructive infertilityubal, SOI）是指由于急、慢性輸卵管炎導(dǎo)致輸卵管粘連、堵塞等異常情況而導(dǎo)致的不孕，主要表現(xiàn)為下腹疼痛、陰道分泌物增多等。 研究發(fā)現(xiàn)，SOI占女性不孕癥的25%～35%[1]，給廣大女性的身心健康與家庭和諧帶來嚴(yán)重影響，是亟須解決的臨床難題。 目前，西醫(yī)主要采用輸卵管介入再通治療SOI[2]，然而超過20%的患者在介入再通后預(yù)后不佳[3]。 研究表明，中醫(yī)藥作為輸卵管再通的輔助治療，不僅可以縮短治療時(shí)間，而且可以預(yù)防再梗阻，提高受孕率[4-5]。因此，發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)對(duì)于提高SOI 的臨床療效具有重要意義。

丹荔輸通湯系全國名老中醫(yī)藥專家楊秉秀教授治療SOI 的經(jīng)驗(yàn)方，臨床治療中發(fā)現(xiàn)，本方能降低SOI 患者臨床中醫(yī)證候積分，治療組總有效率為89.66%，輸卵管通暢率為77.59%，均明顯高于對(duì)照組(慶大霉素混懸液宮腔注藥)，臨床療效顯著[6]，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。 故以慢性輸卵管炎性阻塞模型大鼠，經(jīng)不同劑量丹荔輸通湯灌胃、灌腸治療30 d 后，檢測(cè)模型大鼠輸卵管組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白的表達(dá)，探討丹荔輸通湯對(duì)慢性輸卵管炎性阻塞模型大鼠的影響和作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD 雌性大鼠84 只，鼠齡8～12 周，體質(zhì)量180～200 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（SPF 級(jí)），合格證書編號(hào)：1107272011007368。 將所有大鼠于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)溫度為18～24℃，濕度為30%～70%。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理編號(hào)：LLBH-20190720006。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及主要儀器

丹荔輸通湯的藥物組成：丹參15 g，荔枝核15 g，劉寄奴15 g，王不留行10 g，桃仁10 g，赤芍10 g，生黃芪15 g，太子參15 g 等，中藥飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。西藥混懸液：阿奇霉素干混懸劑（輝瑞制藥有限公司），批號(hào)：200101，規(guī)格：0.1 g/包，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院西藥房，加蒸餾水10 mL，制成阿奇霉素混懸液。 造模藥物：液化苯酚（500 g×1 瓶），購自湖南麥克林試劑有限公司，藥品批號(hào)：P815401；羧甲基纖維素鈉（500 g×1 瓶），購自湖南麥克林試劑有限公司，藥品批號(hào)：C804625。主要試劑：#41003 型GelRed 染料（Biotium）；兔抗鼠TGF-β1、Smad2 多克隆抗體（武漢proteintech公司）；Smad3 單克隆抗體（武漢proteintech 公司）；山羊抗兔IgG 二抗（武漢proteintech 公司）。 主要儀器：輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（徠卡RM2235）；生物組織攤片機(jī)（金迪YD-A）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒DNP-9162）；數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（Motic 6.0）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（WaferGen Biosystems）；電泳儀（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模藥物制備

15%苯酚糊劑：液化苯酚3 mL，加蒸餾水至20 mL，加入適量羧甲基纖維素鈉，用玻璃攪拌棒充分?jǐn)嚢瑁{(diào)制成糊劑。

2.2 模型制備

采用苯酚明膠化學(xué)法制備慢性輸卵管炎性阻塞大鼠模型[7]，以10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉，待麻醉生效后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，腹部剪毛備皮，聚維酮碘消毒，鋪無菌巾，于恥骨聯(lián)合向上約0.5 cm 處作長1.0～1.5 cm 縱形切口，打開腹腔，暴露Y 形子宮，沿子宮向上尋找雙側(cè)輸卵管，于子宮角靠近輸卵管處向兩側(cè)輸卵管分別注入15%苯酚糊劑各0.03 mL，逐層縫合創(chuàng)口，關(guān)閉腹腔。 術(shù)中如發(fā)現(xiàn)大鼠存在子宮炎癥或注入藥物時(shí)有阻力，予以剔除。 術(shù)后消毒術(shù)區(qū)，鋪無菌墊料。

將84 只SD 雌性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取11 只作為空白組，余下73只大鼠依照上述造模方式進(jìn)行造模，于造模第25 天，空白組及模型組分別隨機(jī)選取3 只大鼠，以10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉，待麻醉生效后，取大鼠雙側(cè)輸卵管組織進(jìn)行肉眼及光鏡下HE 染色病理觀察是否造模成功。 見空白組大鼠輸卵管管腔形態(tài)規(guī)則，管壁富有彈性，質(zhì)地柔軟，色澤鮮亮，未見充血、腫脹、扭曲等病變，與周圍組織無粘連。模型組大鼠輸卵管管腔扭曲、畸形，管壁結(jié)締組織增生纖維化，質(zhì)硬，管壁增粗、阻塞，充血、水腫較為明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤，與周圍組織廣泛粘連。 確定模型制備成功，在制備模型過程中，有4 只大鼠死亡。

2.3 分組及給藥

將84 只雌性SD 大鼠隨機(jī)選取11 只大鼠作為空白組，余下73 只大鼠制備慢性輸卵管炎性阻塞大鼠模型，將造模后大鼠隨機(jī)分為模型組、高劑量灌胃+灌腸組、中劑量灌胃+灌腸組、低劑量灌胃+灌腸組、中劑量灌胃組、對(duì)照組，每組各11 只。

模型制備成功后，將中藥飲片水煎至生藥含量7 g/mL 濃縮煎劑，按人體用藥量換算成大鼠等效劑量作為大鼠用藥量[8]，高劑量灌胃+灌腸組、中劑量灌胃+灌腸組、低劑量灌胃+灌腸組給藥量分別為14、7、3.5 g/（kg·d），灌胃容積均為3 mL，灌腸容積為2 mL，1 次/ d。

造模第31 天開始，予模型組生理鹽水灌胃30 d，予高劑量灌胃+灌腸組14 g/（kg·d）、中劑量灌胃+灌腸組7 g/（kg·d）、低劑量灌胃+灌腸組3.5g/（kg·d）丹荔輸通湯灌胃，灌腸30 d，予中劑量灌胃組丹荔輸通湯中劑量7 g/（kg·d）灌胃30 d，予對(duì)照組阿奇霉素混懸液（10 mg·kg-1）灌胃7 d，1 次/d，其余23 d灌胃等容積生理鹽水，1 次/d，灌胃容積均為3 mL，灌腸容積為2 mL。

2.4 標(biāo)本采集

各組大鼠不同劑量灌胃、灌腸30 d 后，于當(dāng)天21:00 開始，禁食不禁飲12 h 后，次日9:00 以10%水合氯醛0.3 mL/100 g 進(jìn)行腹腔注射麻醉，待麻醉生效后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，腹部剪毛備皮，碘酊消毒，鋪巾，于恥骨聯(lián)合向上約0.5 cm 處剪縱形切口，長1.0～1.5 cm，打開腹腔，暴露Y 形子宮，沿子宮向上尋找雙側(cè)輸卵管，取雙側(cè)輸卵管組織，用4%多聚甲醛組織固定液固定標(biāo)本，HE 染色后光鏡下觀察其病理學(xué)改變情況。 采用RT-PCR 及Western blot 檢測(cè)輸卵管組織TGF-β1、Smad2、Smad3含量。

2.5 RT-PCR 檢測(cè)輸卵管組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 轉(zhuǎn)錄表達(dá)

提取大鼠輸卵管組織總RNA，進(jìn)行酶標(biāo)儀定量，取2 μL RNA 樣品于PCR 管中，加入3 μL RNA Loading Buffer，振蕩混勻，瞬時(shí)離心直接點(diǎn)樣，140 V，20 min，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作規(guī)范參考Thermo 公司反轉(zhuǎn)錄酶說明書。 實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)，mRNA 根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量選擇對(duì)應(yīng)規(guī)格并在冰上配制如下反應(yīng)體系。 引物設(shè)計(jì)與合成：TGF-β1 上游引物GACCGCAACAACGCAATCTAT；下游引物CGTGTTGCTCCACAGTTGAC。 Smad2 上游引物CGTCGGAAGAGGAAGGAACAA；下游引物TGGTAAATCTACCCTGCACCC。Smad3上游引物GGAGGAGAAGTGGTGCGAGAA；下游引物GCCACAAGCGGCAGTA GAT。PCR 反應(yīng)體系：配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（20 μL），置于PCR 儀中，65 ℃5 min，25 ℃5 min，42 ℃60 min，循環(huán)40 次，70 ℃5 min。 PCR 產(chǎn)物長度：160、83、200 bp。 采用2－ΔΔCt法計(jì)算大鼠輸卵管組織中TGFβ1、Smad2、Smad3 相對(duì)表達(dá)水平。

2.6 Western blot 法檢測(cè)輸卵管組織標(biāo)本中TGFβ1、Smad2、Smad3 蛋白的表達(dá)

提取輸卵管組織蛋白，BCA 法蛋白定量，電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜完成，麗春紅染色試劑染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果，泳道標(biāo)記，浸沒膜于3%BSA-TBST 中室溫輕搖30 min 封閉，3%BSA-TBST 稀釋一抗，室溫孵育10 min，放4 ℃過夜，第2 天在室溫孵育30 min。TBST 洗膜5 次，每次3 min，二抗孵育，5%脫脂奶粉-TBST 稀釋二抗，山羊抗兔IgG（H+L） HRP，1∶10 000，室溫輕搖40 min。 洗膜：TBST 洗膜6 次，每次3 min，隨后將ECL 加到膜上后反應(yīng)3～5 min，膠片曝光定影后掃描，以β-actin 為內(nèi)參照，軟件Total Lab Quant V11.5 讀取條帶積分光密度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“±s”表示，首先對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若各組數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，采用方差齊性檢驗(yàn)，若不滿足正態(tài)分布，則用秩和檢驗(yàn)；若方差齊，采用ANOVA 檢驗(yàn)，若方差不齊，則采用Dunnett's 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠輸卵管形態(tài)肉眼觀察結(jié)果

經(jīng)實(shí)驗(yàn)給藥30 d 后，處死全部大鼠，取各組大鼠子宮及輸卵管組織，肉眼觀察各組大鼠輸卵管組織解剖形態(tài)變化。 空白組輸卵管形態(tài)正常，色澤紅潤，有光澤，質(zhì)地柔軟，管壁彈性佳，與周圍組織無明顯粘連，無積水或積膿；模型組見輸卵管形態(tài)明顯增粗、腫脹、扭曲，色蒼白，無光澤，質(zhì)地硬，管壁彈性差，與周圍組織致密粘連，積水明顯，部分積膿；高劑量灌胃+灌腸組、中劑量灌胃+灌腸組、低劑量灌胃+灌腸組、中劑量灌胃組、對(duì)照組的輸卵管形態(tài)、色澤、質(zhì)地、管壁彈性、與周圍組織粘連、積水或積膿情況均較模型組改善，且高劑量灌胃+灌腸組、中劑量灌胃+灌腸組、低劑量灌胃+灌腸組、中劑量灌胃組的輸卵管形態(tài)、色澤、質(zhì)地、管壁彈性均優(yōu)于對(duì)照組。

3.2 各組大鼠輸卵管HE 染色觀察結(jié)果

經(jīng)實(shí)驗(yàn)給藥30 d 后，處死全部大鼠，取各組大鼠輸卵管組織，HE 染色后光鏡下觀察其病理學(xué)改變情況。

空白組：輸卵管管壁及管腔大小正常，黏膜光滑，皺襞數(shù)量多，纖毛蠕動(dòng)正常，細(xì)胞形態(tài)正常，未見明顯纖維化滲出物。 模型組：輸卵管管壁增厚，管腔狹窄、堵塞，黏膜充血，皺襞數(shù)量極少，細(xì)胞水腫明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤，可見纖維化滲出物及結(jié)締組織增生。 高劑量灌胃+灌腸組：輸卵管管壁稍增粗，管腔通暢，管腔大小正常，結(jié)構(gòu)較清晰，黏膜光滑，皺襞數(shù)量多，細(xì)胞形態(tài)大致正常，可見極少量纖維化滲出物。 中劑量灌胃+灌腸組：輸卵管尚通暢，管壁稍增厚，管腔大小正常，結(jié)構(gòu)較清晰，黏膜光滑，皺襞數(shù)量較多，細(xì)胞形態(tài)大致正常，可見極少量纖維化滲出物及結(jié)締組織增生。 低劑量灌胃+灌腸組：輸卵管尚通暢，管壁稍增厚，管腔縮小，結(jié)構(gòu)稍紊亂，黏膜輕度充血，皺襞數(shù)量減少，炎性細(xì)胞浸潤，可見少量纖維化滲出物及結(jié)締組織增生。中劑量灌胃組：輸卵管尚通暢，管壁稍增厚，管腔縮小，結(jié)構(gòu)稍紊亂，黏膜輕度充血，皺襞數(shù)量減少，炎性細(xì)胞浸潤，可見少量纖維化滲出物及結(jié)締組織增生。 對(duì)照組：輸卵管尚通暢，偶見輕度堵塞，管壁稍增厚，管腔縮小，結(jié)構(gòu)稍紊亂，黏膜輕度充血，皺襞數(shù)量減少，細(xì)胞輕度水腫，可見少量纖維化滲出物及結(jié)締組織增生。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠輸卵管形態(tài)結(jié)果（HE 染色，×200）

3.3 各組輸卵管組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)結(jié)果

與空白組相比，模型組大鼠輸卵管組織中的TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 治療后，與模型組相比，高劑量灌胃+灌腸組、中劑量灌胃+灌腸組、低劑量灌胃+灌腸組、中劑量灌胃組、對(duì)照組大鼠輸卵管組織中的TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。高、中劑量灌胃+灌腸組大鼠輸卵管組織中的TGF-β1 mRNA 表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但兩組大鼠輸卵管組織中的TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)量均低于低劑量灌胃+灌腸組、中劑量灌胃組、對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 詳見表1，圖2-4。

圖3 Smad2 mRNA PCR 擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線（上）和熔解曲線（下）

圖4 Smad3 mRNA PCR 擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線（上）和熔解曲線（下）

表1 各組大鼠輸卵管組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s，=6）

表1 各組大鼠輸卵管組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s，=6）

注：與空白組相比，ΔP＜0.01；與模型組相比，○P＜0.01；與高劑量灌胃+灌腸組相比，★P＜0.01；與中劑量灌胃+灌腸組相比，◆P＜0.01。

組別空白組模型組高劑量灌胃+灌腸組中劑量灌胃+灌腸組低劑量灌胃+灌腸組中劑量灌胃組對(duì)照組劑量（g/kg·d-1）10 10 14 7 3.5 7 0.01 TGF-β1 1.06±0.37 7.70±0.86Δ 4.61±0.57○4.80±0.61○6.15±0.33○★◆6.48±0.66○★◆6.67±0.44○★◆Smad2 1.08±0.43 6.23±0.58Δ 3.44±0.51○3.46±0.54○4.53±0.44○★◆4.50±0.55○★◆4.42±0.51○★◆Smad3 1.10±0.49 7.08±0.65Δ 3.70±0.57○3.51±0.38○5.52±0.42○★◆5.48±0.50○★◆5.58±0.58○★◆

3.4 各組輸卵管組織TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表達(dá)結(jié)果

TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白在各組大鼠輸卵管組織中均有表達(dá)，與空白組相比，模型組大鼠輸卵管組織中的TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 治療后，與模型組相比，高、中、低劑量灌胃+灌腸組，中劑量灌胃組，對(duì)照組大鼠輸卵管組織中的TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。高、中劑量灌胃+灌腸組大鼠輸卵管組織中的TGFβ1 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但兩組大鼠輸卵管組織中的TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白的表達(dá)均低于低劑量灌胃+灌腸組、中劑量灌胃組、對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 詳見圖5-8。

圖5 各組輸卵管組織Smad3 蛋白表達(dá)

圖6 各組輸卵管組織Smad2 蛋白表達(dá)

圖7 各組輸卵管組織TGF-β1 蛋白表達(dá)

圖8 Western blot 檢測(cè)各組大鼠輸卵管組織TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表達(dá)

4 討論

SOI 在中醫(yī)古籍中并無相同病名，根據(jù)SOI 的臨床表現(xiàn)，其可歸屬于“不孕癥”“斷續(xù)”“無子”“婦人腹痛”“癥瘕”等疾病范疇[9]。 中醫(yī)古籍多認(rèn)為，血瘀為本病發(fā)生發(fā)展的主要病機(jī)[10]，究其形成原因，多因肝氣郁結(jié)、寒濕外襲、熱瘀互結(jié)、腎氣不足等導(dǎo)致血行停滯成瘀，瘀阻胞絡(luò)，故不能攝精成孕。氣為血之帥，氣機(jī)調(diào)暢則血液運(yùn)行暢通無阻，女子素體易郁，加之思慮過度，導(dǎo)致肝氣郁結(jié)，氣滯不行則血液運(yùn)行停滯，氣滯血瘀則孕卵不能正常排出，女子難以受孕。外感寒邪，或久食生冷之品，寒濕內(nèi)生，阻滯沖任，亦可使孕卵排出受阻。過食辛辣或肥甘厚膩之品，或血瘀日久化熱，瘀熱互結(jié)于沖任，則精卵難以結(jié)合。 腎精虧虛，則沖任不充，氣血失調(diào)，血行停滯，日久成瘀，在此基礎(chǔ)上，歷代醫(yī)家建立了活血化瘀的治療原則。輸卵管炎型不孕癥以氣滯血瘀證型多見[11]，如匡繼林選用活血化瘀通絡(luò)之通管方治療宮腹腔鏡術(shù)后輸卵管性不孕癥患者，降低其炎癥因子血清IL-6、TNF-α 水平表達(dá)，有效提高了臨床妊娠率[12]。

第四批全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承指導(dǎo)老師楊秉秀教授經(jīng)過60 余年臨床探索，研制出丹荔輸通湯治療SOI，取得較好的臨床療效，該方主要由丹參、荔枝核、劉寄奴、王不留行、桃仁、赤芍、生黃芪、太子參等藥物組成。君藥為丹參，丹參味苦，性微寒，歸肝、胃經(jīng)，具有活血化瘀、涼血消癰的作用。 臣藥為荔枝核、劉寄奴、王不留行、桃仁、赤芍，荔枝核具有行氣散結(jié)，祛寒止痛的效果；劉寄奴有破血通經(jīng)，止血消腫之功；王不留行有活血通經(jīng)，消腫利尿的作用；桃仁長于活血祛瘀；赤芍具有清熱涼血、散瘀止痛的功效，四藥均有活血化瘀的作用，合用則活血化瘀效果愈彰。 佐藥為生黃芪、太子參，生黃芪有補(bǔ)氣固表，托毒排膿，利尿，生肌的作用，且行氣以助血行，上下通行脈絡(luò)，瘀血難生；太子參功擅益氣健脾，生津潤肺，氣能行血，氣能行瘀，生黃芪、太子參能健脾益氣，脾氣健運(yùn)則血液運(yùn)行無阻，扶正祛邪，二藥還可達(dá)到固護(hù)脾胃的作用，使諸藥行氣活血、化瘀消癥而無礙脾胃。全方標(biāo)本兼施，體現(xiàn)攻補(bǔ)兼施、消散結(jié)合、氣血兼顧的治療特點(diǎn)，使得氣血旺盛、瘀血蕩滌、脈絡(luò)通暢，從而使輸卵管的充血消退、水腫減輕、纖維化緩解。

TGF-β 超家族在哺乳動(dòng)物基因組編碼主要存在3 種亞型，即TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3，3 種亞型具有相似的細(xì)胞靶標(biāo)[13]。 其中，TGF-β1 是組織纖維化發(fā)展最主要的因子[14]。目前，發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物中的Smads 蛋白至少有8 種， 可根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)的不同分為3 種亞型[15]，其中，Smad2、Smad3 為受體激活型[16]。 研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smads 信號(hào)通路參與了輸卵管炎的重要環(huán)節(jié)，是婦科臨床及實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)所在。 程曉嫚等[17]臨床應(yīng)用針灸調(diào)沖任法對(duì)SOI模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)治療后模型大鼠輸卵管組織中TGF-β1、Smad3 蛋白的表達(dá)水平顯著降低，輸卵管組織纖維化程度得到良好改善。 羅志娟等[18]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，道地通管湯可下調(diào)輸卵管炎性大鼠輸卵管組織中TGF-β1、Smad3 表達(dá)，說明道地通管湯可以抑制TGF-β1 及Smads 的增多，對(duì)組織炎癥的病變起到抑制作用，在一定程度上說明道地通管湯的療效與抑制TGF-β1 及Smads 有關(guān)，且給藥30 d治療效果優(yōu)于給藥15 d。

本次實(shí)驗(yàn)中，丹荔輸通湯能夠抑制慢性輸卵管炎性阻塞模型大鼠輸卵管組織中的TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白及mRNA 的表達(dá)，以高、中劑量灌胃+灌腸組的療效最為顯著（P＜0.01）。在給藥途徑與劑量上，高、中劑量灌胃+灌腸組療效明顯優(yōu)于中劑量灌胃組（P＜0.01）。 中藥灌腸給藥是中醫(yī)外治法之一，直腸給藥能透達(dá)盆腔病灶，相對(duì)減輕肝臟對(duì)藥物的首過效應(yīng)，減少對(duì)胃腸黏膜刺激，從而使藥物吸收及利用率得以增強(qiáng)。 此外，中藥灌腸也可能通過改善機(jī)體血液流變學(xué)，增加局部的血液循環(huán)及營養(yǎng)狀況，提高毛細(xì)血管的通透性，促進(jìn)炎癥的快速吸收，加快細(xì)胞新陳代謝，改善輸卵管局部微環(huán)境，減輕炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)等。 因此，高、中劑量灌胃+灌腸組聯(lián)合用藥具有良好的抗炎作用，可減少炎性滲出及結(jié)締組織增生，抑制輸卵管組織纖維化，將在輸卵管炎性不孕疾病的治療中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，丹荔輸通湯可能通過降低輸卵管炎性阻塞模型大鼠輸卵管組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 與蛋白的表達(dá)，抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而減輕模型大鼠輸卵管組織炎癥及纖維化程度，改善輸卵管功能，發(fā)揮治療作用。但是丹荔輸通湯具體如何參與TGF-β1/Smads 信號(hào)通路，哪些蛋白是關(guān)鍵因子尚未明確，這些均為后續(xù)研究的重點(diǎn)。 本次研究為臨床治療慢性輸卵管炎及SOI 提供了科學(xué)客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，亦為中藥新藥的研發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。