黃芩苷對缺氧三陰性乳腺癌干細胞增殖及HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin 的影響

肖玉潔，黃立中，龔 輝，戴新軍，朱 旭，馮 磊，王 婷

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006；3.株洲市中心醫(yī)院，湖南 株洲 412007）

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）是乳腺癌中最具侵襲性的亞型，缺乏內(nèi)分泌治療及靶向治療藥物，預(yù)后差[1]。 乳腺癌干細胞的自我更新分化是乳腺癌發(fā)生和復(fù)發(fā)的重要機制，參與調(diào)控乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移、對放化療的治療抵抗[2]。 乳腺癌干細胞常位于腫瘤的缺氧區(qū)域，低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的核轉(zhuǎn)錄因子，缺氧環(huán)境下TNBC 細胞中乳腺癌干細胞比例的增加歸因于HIF-1α 的激活，且HIF-1α 的激活與TNBC 的轉(zhuǎn)移率和死亡率增加有關(guān)[3]。 HIF-1α 調(diào)節(jié)70 多個基因，如血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、白血病-2 基因等，調(diào)控惡性腫瘤的細胞增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。本課題組前期實驗結(jié)果顯示，缺氧乳腺癌干細胞MDA-MB-231 的HIF-1α、胰島素樣生長因子-Ⅱ（insulin-like growth factor, IGF-Ⅱ）、L-選擇素（L-selectin）表達上調(diào)[5]。

TNBC 歸屬于中醫(yī)學(xué)“乳巖”范疇，肝郁氣滯，瘀毒互結(jié)是主要病因病機，癌毒乃痰濁、瘀血等病理產(chǎn)物阻于乳絡(luò)，蘊結(jié)不解，日久而生，癌毒是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，抗癌解毒是重要治則[6]。 清熱解毒中藥黃芩為治療乳腺癌的常用藥，黃芩苷是黃芩的主要活性成分，黃芩苷能抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[7]。本研究從HIF-1α 信號通路研究黃芩苷對缺氧乳腺癌干細胞增殖的抑制效應(yīng)及作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231（青旗生物技術(shù)發(fā)展有限公司，批號：BFN608008564），懸浮培養(yǎng)分離出乳腺癌干細胞微球體MDA-MB-231[5]。

1.2 主要試劑

黃芩苷（北京索萊寶科技有限公司，批號：SB8020）；HIF-1α 抑制劑2-ME（美國MCE 公司，批號：JH1838）；順鉑（cisplatin，DDP）注射液（云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，批號：20160326）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號：10091-148）；B27 培養(yǎng)基（美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號：17504044）；BCA 蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0009）；四甲基偶氮唑藍（methyl thiazoly tetrazolium,MTT，批號：BTN111105）、Trizol（批 號：12183-555）均購自美國Sigma 公司；培養(yǎng)細胞總RNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號：DP42050）；RTPCR 試劑（日本Takara 公司，批號：RR037B）；鼠抗人HIF-1α 單克隆抗體（批號：ab129733）、鼠抗人IGF-Ⅱ單克隆抗體（批號：ab213903）、鼠抗人L-selectin單克隆抗體（批號：ab199085）、β-action 單克隆抗體（批號：ab120629）均購自英國Abcam 公司；山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：BL021A）。

1.3 主要儀器

倒置顯微鏡（重慶光電儀器總公司，型號：XDS-1B）；凝膠成像分體系統(tǒng)（英國Syngene 公司，型號：GBOX-HR）；水平電泳儀（型號：1658001）、RT-PCR儀（型號：CFX96TOUCH）均購自美國Bio-Rad 公司。

1.4 藥物的制備

1.4.1 黃芩苷的制備 將黃芩苷均勻溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，配制成濃度為200.0 mg/L 的儲存液[8]，4 ℃冰箱內(nèi)避光保存，使用時用細胞培養(yǎng)基稀釋成所需的濃度，DMSO 的終濃度≤0.2%。

1.4.2 HIF-1α 抑制劑2-ME 的制備 將2-ME 用DMSO 溶解， 使用時用培養(yǎng)基稀釋為0.5 μmol/L[9]，DMSO 的終濃度≤0.2%。

1.4.3 DDP 溶液的制備 將DDP 注射液用PBS溶解為1 mg/mL 的藥液，使用時用培養(yǎng)基稀釋為5 μg/mL[10]。

1.5 細胞培養(yǎng)

將人乳腺癌干細胞MDA-MB-231 按1×105個/mL接種于含有10 ng/mL 堿性成纖維細胞生長因子、20 ng/mL 表皮生長因子、0.4% B27、1%青鏈霉素的DMEM-F12 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2、1% O2的三氣培養(yǎng)箱中，隔兩天換1 次培養(yǎng)基，待細胞密度接近80%時傳代。

1.6 MTT 法檢測細胞增殖

根據(jù)本課題前期研究[11]，將缺氧乳腺癌干細胞MDA-MB-231 隨機采用不同濃度（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L）的黃芩苷進行干預(yù)。 取對數(shù)生長期細胞接種于96 孔板，每孔1.0×104個細胞；24 h后每孔加入不同藥物的培養(yǎng)基100.0 μL；缺氧條件下培養(yǎng)72 h 后，將10 μL MTT 加入每孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，每孔加入10%十二烷基磺酸鈉（100.0 μL/孔），在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，每組設(shè)5 個復(fù)孔。用酶標儀分別于490 nm 及630 nm 波長處測定光密度（optical density, OD）值。細胞生長抑制率=（1－某濃度黃芩苷時的OD 值/未給黃芩苷時的OD 值）×100%[8]。

1.7 實驗分組

將缺氧乳腺癌干細胞MDA-MB-231 隨機分為10 組：對照組、BL 組（黃芩苷低濃度50.0 mg/L）、BM 組（黃芩苷中濃度100.0 mg/L）、BH 組（黃芩苷高濃度200.0 mg/L）、DDP 組、M 組（2-ME）、BL+M組、BM+M 組、BH+M 組、DDP+M 組。

1.8 RT-PCR 檢測HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin mRNA的表達

按照培養(yǎng)細胞總RNA 提取試劑盒的操作說明提取各組細胞的總RNA。 按后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取出相應(yīng)所需量的總RNA，立即進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：37 ℃15 min 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)3 次，85 ℃5 s反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)1 次。 設(shè)計和合成PCR 的引物。 采用兩步法RT-PCR 反應(yīng)：93 ℃2 min 預(yù)變性，然后按93 ℃1 min，60 ℃1 min，共40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認RT-PCR 的擴增曲線和熔解曲線，進行PCR 實時定量制作標準曲線。 用ABI 7500 軟件進行分析。 引物序列見表1。

表1 各基因的引物序列

1.9 Western blot 檢測HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin蛋白的表達

收集細胞提蛋白，取蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，將含有目的蛋白條帶的硝酸纖維素膜與相應(yīng)一抗反應(yīng)后，4 ℃過夜，PBS 洗膜，與相應(yīng)稀釋后的二抗反應(yīng)，室溫孵育2 h，避光顯色。掃描條帶。用Image J 分析軟件將每個特異條帶的灰度值進行量化。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)均用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件分析。 計量資料以“±s”表示，先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性時，兩兩比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。 不滿足正態(tài)分布及方差齊性時采用秩和檢驗。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度黃芩苷對細胞生長抑制率的影響

與對照組比較，DDP 組及不同濃度黃芩苷的細胞生長抑制率均明顯升高（P＜0.05）。 與黃芩苷200.0 mg/L比較，其他濃度黃芩苷的細胞生長抑制率均明顯降低（P＜0.05），DDP 組細胞生長抑制率明顯升高（P＜0.05）。 詳見圖1。

圖1 DDP 及不同濃度黃芩苷對細胞生長抑制率的影響

2.2 各組細胞HIF-1α、L-selectin、IGF-ⅡmRNA表達情況

與對照組比較，其余9 組HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin mRNA 表達均明顯降低（P＜0.05）。 與BL 組比較，BM 組、BH 組、BL+M 組HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin mRNA 表達均明顯降低（P＜0.05）。與BM 組比較，BM+M 組HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin mRNA 表達均明顯降低（P＜0.05）。 與BH 組比較，BH+M 組HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin mRNA 表達均明顯降低（P＜0.05）。 詳見表2。

表2 缺氧乳腺癌干細胞HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin mRNA 表達比較（±s，n=3）

表2 缺氧乳腺癌干細胞HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin mRNA 表達比較（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與BL 組比較，#P＜0.05；與BM 組比較，ΔP＜0.05；與BH 組比較，◆P＜0.05。

組別對照組BL 組BM 組BH 組DDP 組M 組BL+M 組BM+M 組BH+M 組DDP+M 組HIF-1α 1.00±0.16 0.49±0.04*0.28±0.06*#0.21±0.05*#0.12±0.05*0.33±0.09*0.15±0.03*#0.12±0.03*Δ 0.09±0.01*◆0.06±0.01*IGF-Ⅱ1.00±0.12 0.52±0.04*0.41±0.02*#0.32±0.02*#0.21±0.09*0.33±0.12*0.18±0.05*#0.09±0.03*Δ 0.03±0.02*◆0.12±0.01*L-selectin 1.00±0.07 0.43±0.02*0.36±0.01*#0.29±0.02*#0.25±0.02*0.68±0.08*0.35±0.01*#0.22±0.06*Δ 0.15±0.01*◆0.11±0.02*

2.3 各組細胞HIF-1α、L-selectin、IGF-Ⅱ蛋白表達情況

與對照組比較，其余9 組HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）。 與BL 組比較，BM組、BH 組、BL+M 組HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin 蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）。 與BM 組比較，BM+M組HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin 蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）。 與BH 組比較，BH+M 組HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin 蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖2、表3。

表3 各組細胞HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin 蛋白表達比較（±s，n=3）

表3 各組細胞HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin 蛋白表達比較（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與BL 組比較，#P＜0.05；與BM 組比較，ΔP＜0.05；與BH 組比較，◆P＜0.05。

組別對照組BL 組BM 組BH 組DDP 組M 組BL+M 組BM+M 組BH+M 組DDP+M 組HIF-1α 2.13±0.08 0.86±0.08*0.71±0.02*#0.68±0.09*#0.62±0.02*0.16±0.01*0.15±0.03*#0.13±0.01*Δ 0.11±0.02*◆0.09±0.01*IGF-Ⅱ1.35±0.07 0.57±0.06*0.29±0.01*#0.28±0.05*#0.21±0.01*0.72±0.02*0.45±0.04*#0.22±0.03*Δ 0.18±0.01*◆0.17±0.02*L-selectin 1.62±0.06 0.45±0.04*0.36±0.03*#0.30±0.02*#0.26±0.02*0.87±0.09*0.38±0.04*#0.27±0.01*Δ 0.19±0.02*◆0.15±0.02*

圖2 各組細胞HIF-1α、L-selectin、IGF-Ⅱ蛋白表達電泳圖

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，且近年來發(fā)病率逐漸上升，嚴重威脅女性的健康[12]。 TNBC 約占全部乳腺癌的15%，侵襲性強，缺乏內(nèi)分泌治療，預(yù)后差，靶向治療是發(fā)展的方向[13]。 癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，一是腫瘤干細胞，二是腫瘤微環(huán)境。 與其他分子分型的乳腺癌比較，TNBC 腫瘤干細胞表達的比例是最高的。 將乳腺癌干細胞作為治療靶點，針對其相關(guān)信號通路、細胞穩(wěn)態(tài)以及微環(huán)境研發(fā)有效的治療藥物是TNBC 治療的潛在策略[14]。 缺氧微環(huán)境促進了腫瘤干細胞的富集和耐藥性，靶向缺氧微環(huán)境可以抑制TNBC 干細胞的增殖，增強TNBC 對DDP 的敏感性[15]。HIF-1α 信號通路是缺氧微環(huán)境的關(guān)鍵通路，調(diào)控HIF-1α 信號通路可以下調(diào)TNBC 干細胞干性[16]。

胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor,IGF）系統(tǒng)，包括IGF-Ⅰ與IGF-Ⅱ、IGF 結(jié)合蛋白及IGF 受體等，是乳腺癌最有力的生長因子[17]。 IGF 信號途徑能夠通過增強細胞外基質(zhì)的侵襲作用，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶及其他遷移所需的黏附分子等機制調(diào)節(jié)遷移，并影響細胞在循環(huán)中的存活。 靶向IGF 系統(tǒng)很有可能成為治療乳腺癌的策略之一[18]。 IGF-Ⅱ是HIF-1α 的下游基因[19]。 乳腺癌優(yōu)先轉(zhuǎn)移到肺、淋巴結(jié)、肝、骨和腦，與L-selectin 的表達增高有關(guān)，Lselectin 可以通過調(diào)節(jié)循環(huán)癌細胞對血管壁的黏附性促進癌細胞的轉(zhuǎn)移[20]。

TNBC 的治療是乳腺癌領(lǐng)域中的難點。TNBC 的病機多為本虛標實之證，因虛致實，虛實相兼，虛者脾腎不足多見，實者氣滯、痰毒、血瘀為主，初起多為標實之象，病久多見本虛之證[21]。 “癌毒”是TNBC 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病機，火毒是TNBC 轉(zhuǎn)移的重要病性，清熱解毒是重要治法[22]。氣滯、痰凝、血瘀、熱毒日久可形成郁火，影響腫瘤微環(huán)境，導(dǎo)致腫瘤的增殖及侵襲，中醫(yī)學(xué)的“火郁發(fā)之”治法可以宣發(fā)郁火，改善腫瘤微環(huán)境從而抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[23]。 中醫(yī)藥治療TNBC 可以改善癥狀，提高生活質(zhì)量，降低轉(zhuǎn)移率，提高生存率及無病生存期[24-25]。 黃芩苷具有誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡、影響細胞周期、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的多靶點作用特點[26-27]，但對乳腺癌干細胞缺氧微環(huán)境的研究較少。

本研究結(jié)果顯示黃芩苷能抑制缺氧乳腺癌干細胞MDA-MB-231 生長，而且呈濃度依賴性，濃度越高，抑制效果越明顯（P＜0.05）。黃芩苷可以抑制缺氧乳腺癌干細胞HIF-1α、IGF-Ⅱ、L-selectin 蛋白表達，聯(lián)合HIF-1α 抑制劑2-ME 效果更好（P＜0.05）。

隨著對TNBC 研究的不斷深入，中藥抗TNBC的作用機制不斷被發(fā)現(xiàn)，主要包括阻滯細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等[28-30]。 本研究表明中藥黃芩的有效成分黃芩苷可以抑制缺氧乳腺癌干細胞MDA-MB-231 的增殖，可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α/IGF-Ⅱ信號通路和L-selectin 的表達抑制其增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，為黃芩苷治療乳腺癌提供實驗依據(jù)，為中醫(yī)藥防治乳腺癌提供新靶點、新思路。