按法干預(yù)對大鼠激痛點骨骼肌細胞骨架α-tubulin 和MAP-4 的影響

匡小霞，蔣全睿，吳 瓊，賴畇綺，馮 祥，朱曉晴，李江山，李 武

（湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿與康復學院，湖南 長沙 410208）

激痛點（myofascial trigger points, MTrPs）是肌肉內(nèi)高度敏感的應(yīng)激點，活化后會引起肌肉劇烈疼痛和功能障礙，還可能導致感覺異常和自主神經(jīng)異常等癥狀，是疼痛患者就診的常見體征[1]。 研究表明，活化MTrPs 是常見頸肩腰腿疼痛的一個重要因素[2]，MTrPs 導致長期感覺、運動和自主神經(jīng)癥狀，還可能誘發(fā)失眠和精神焦慮，嚴重影響患者工作能力和生活質(zhì)量。 《素問·調(diào)經(jīng)論》曰：“按之則氣足以溫之，故快然而不痛。 ”臨床中按法常用于各種軟組織損傷，對壓痛點、筋結(jié)、腧穴等進行刺激，促進損傷修復，緩解疼痛，大量臨床證據(jù)均證明按法刺激對MTrPs 具有良好的去活化作用[3-4]，根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論可概括為舒筋解結(jié)效應(yīng)。

本研究團隊近年以按法對MTrPs 去活化效應(yīng)及其機制進行了系列研究工作，以期全面揭示按法舒筋解結(jié)的效應(yīng)機制。研究發(fā)現(xiàn)，按法刺激可以有效緩解MTrPs 疼痛，降低局部軟組織張力，有效促進線粒體能量代謝和肌肉組織修復[5-7]。 在研究過程中，本研究團隊發(fā)現(xiàn)MTrPs 肌肉細胞存在超微結(jié)構(gòu)損傷，而線粒體能量代謝和超微結(jié)構(gòu)損傷兩者均與細胞骨架功能密切相關(guān)[8-9]。 細胞骨架是絲狀聚合物和調(diào)節(jié)蛋白的互連網(wǎng)絡(luò)，微管是其重要組成部分，具有支撐和物質(zhì)運輸?shù)淖饔肹10]。 α 微管蛋白（α-tubulin）是構(gòu)成微管的主要蛋白之一，微管結(jié)合蛋白4（microtubule-associated protein 4, MAP-4）附著于微管上，參與微管的組裝并增加微管的穩(wěn)定性。因此，本實驗研究建立大鼠MTrPs 模型，探索按法干預(yù)對微管蛋白α-tubulin 及微管結(jié)合蛋白MAP-4 表達的影響，以期更好地揭示按法舒筋解結(jié)的科學內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級健康SD 大鼠40 只，雄性，體質(zhì)量180～200 g，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物許可證書：SYXK（湘）2019-0009。 分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物中心，每籠3 只，自由飲食、飲水。飼養(yǎng)環(huán)境12 h 明/暗周期，溫度24～26 ℃，濕度50%～70%。40 只大鼠隨機分為空白組10 只和參與MTrPs造模大鼠30 只。 空白組不進行造模和干預(yù)操作，僅正常飼養(yǎng)；參與MTrPs 造模的大鼠經(jīng)過8 周鈍性打擊結(jié)合離心運動處理，死亡0 只，滿足模型評價共計24 只，隨機抽取4 只作為其他實驗使用，其余20 只大鼠以隨機數(shù)表法分為模型組和按法組，每組10只。實驗過程中對動物的處置符合《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》[11]相關(guān)規(guī)定，實驗方案由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準并通過（批準編號：LL2019092506）。

1.2 主要試劑與儀器

呼吸麻醉機（型號：R500 通用型，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；跑步機（型號：C100 型，浙江省金華市宇晟運動公司）；按法刺激器與擊打器（自制）；多導生理記錄儀（型號：MP150，BIOPAC systems），電泳儀（型號：Mini protean 3 cell, Bio-Rad Laboratories），轉(zhuǎn)印槽（型號：Mini TransBlot，Bio-Rad Laboratories）；全自動化學發(fā)光分析儀（型號：Tanon-520，上海天能科技有限公司）；正置熒光顯微鏡以及成像系統(tǒng)（型號：Nikon eclipse ti-sr、Ds-u3，日本尼康株式會社）；異氟烷（批號：R510-22，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；4%多聚甲醛溶液（批號：BL539A，Biosharp）；兔來源MAP-4 多克隆抗體（批號：AF0079，Affinity）； 兔來源MAP-4 多克隆抗體（批號：A17314，Aabsci）；兔來源α-tubulin 多克隆抗體（批號：AF7010，Affinity）；兔來源GAPDH 多克隆抗體（批號：AF7021，Affinity）；HRP 標記山羊抗兔鼠通用二抗（批號：K5007，DAKO）；Cy3 驢抗山羊熒光二抗（批號：705-165-003，Jackson）；TSA-488（批號：PNF0512，武漢市皮諾飛生物科技有限公司）；DAPI（批號：C0060，北京索萊寶科技有限公司）；抗熒光淬滅封片劑（批號：0100-1，Southbiotech）；蛋白提取液（批號：MDL91201）、蛋白酶抑制劑（批號：MD912893）、BCA 蛋 白 濃 度 測 定 試 劑 盒（批 號：MD913053）均來自北京百奧思科生物醫(yī)學技術(shù)有限公司。

1.3 MTrPs 模型制備與模型評價

參考文獻[12-13]采用鈍性打擊結(jié)合離心運動的方法造模，分為處理期（8 周）和恢復期（4 周）。 造模前，參與造模的大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，并在小動物跑臺內(nèi)進行適應(yīng)性跑臺訓練，以練習跑臺運動并減少應(yīng)激反應(yīng)。跑臺設(shè)置坡度0°、速度16 m/min，隔天1 次，每次15 min，共3 次。

1.3.1 處理期（8 周） 在每周第1 天進行1 次鈍性打擊，具體操作為異氟烷吸入麻醉后（誘導濃度4%），將大鼠仰臥固定于打擊器底端，標記左側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌，打擊器的鈍性木棒從20 cm 高度垂直落下?lián)舸驑擞浳恢? 次。 第2 天進行離心跑臺：將小動物跑臺設(shè)置在-16°下坡跑模式，速度為16 m/min，在跑臺過程中通過機械刺激、聲音刺激等方式驅(qū)趕大鼠，保證完成連續(xù)90 min 的離心運動。 其余5 d正常喂養(yǎng)，不作其他處理。

1.3.2 恢復期（4 周） 每天正常喂養(yǎng)與觀察，不作其他處理。

1.3.3 模型成功標準 觸診造模局部有明顯緊張帶或攣縮結(jié)節(jié)，觸診或電極針刺入可產(chǎn)生抽搐反應(yīng)，肌電圖出現(xiàn)高頻自發(fā)性電活動，則說明造模成功。

1.4 按法操作

根據(jù)鈍性打擊點，在左側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌位置先用手觸摸確定緊張帶或結(jié)節(jié)位置。將實驗大鼠仰臥位放置固定，操作部位局部備皮，用自制的按法操作儀器[14]，按照前期研究[15]調(diào)整好參數(shù)（力量0.7 kg、時間7.5 min、頻率10 次/min），在緊張帶或結(jié)節(jié)位置上進行按壓刺激（注：力量參數(shù)是根據(jù)按壓頭大小，從臨床研究的2.5 kg 換算成動物實驗0.7 kg）。 空白組和模型組不進行按法干預(yù)；按法組給予局部按法干預(yù)（參數(shù)如上述，2 d/次，一共7 次，共計14 d）。

1.5 組織標本采集和處理

干預(yù)與其他檢測結(jié)束后，以10%水合氯醛腹部注射麻醉并脫頸處死大鼠。 用手術(shù)器械對大鼠左側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌緊張帶或膨大結(jié)節(jié)區(qū)域標記處進行組織取材。將組織置于預(yù)冷生理鹽水中，并用生理鹽水清洗血跡，洗滌3 次以上盡可能減少殘留血液，濾紙吸干，標記編號后分別以-80 ℃冰箱或4%多聚甲醛保存。

1.6 指標檢測

1.6.1 Western blot 檢測α-tubulin 和MAP-4 蛋白將組織樣本從-80 ℃冰箱中取出，剪碎，加裂解液勻漿，冰浴后4 ℃、12 000 r/min、半徑8 cm 離心15 min，收集上清。 BCA 蛋白定量法測定總蛋白濃度。制備SDS-PAGE 凝膠（10%分離膠，5%濃縮膠），上樣后電泳并濕轉(zhuǎn)至甲醇處理的PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃過夜；一抗：抗體加入封閉液中稀釋到目標濃度，室溫孵育1 h；二抗：按照1∶10 000 比例稀釋辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標記的二抗，室溫孵育1 h。 孵育后PBST 洗滌并以化學發(fā)光顯影液置于分析儀檢測，截圖以Image J軟件讀取相關(guān)條帶灰度值并利用目的蛋白/甘油醛-3-磷酸脫氫酶計算相對表達量。

1.6.2 免疫熒光雙染色檢測α-tubulin和MAP-4 將組織樣本從多聚甲醛取出，常規(guī)脫水石蠟包埋并切片。切片以二甲苯和梯度酒精脫蠟至水，用檸檬酸抗原修復緩沖液（pH 6.0）在微波爐內(nèi)進行抗原修復。 用過氧化氫溶液和BSA 封閉。 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS 按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。 加二抗：玻片置于PBS 洗滌后切片稍甩干并滴加HRP 的二抗，室溫孵育50 min。 加488-TSA： 玻片置于PBS 洗滌，488-TSA孵育30 min。 抗原修復： 用檸檬酸抗原修復緩沖液（pH 6.0）在微波爐內(nèi)進行抗原修復。加第二種一抗：甩掉封閉液，在切片上滴加PBS 按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。 加二抗：玻片置于PBS 洗滌，稍甩干后滴加與一抗相應(yīng)種屬Cy3的二抗，避光室溫孵育50 min。 DAPI 復染細胞核：玻片置于PBS 洗滌，稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI 染液，避光室溫孵育10 min。 封片：玻片置于PBS 洗滌稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。 以Image J 軟件讀取平均熒光強度，每個樣本隨機選取3 個區(qū)域進行采集并計算，取均值作為其平均熒光強度數(shù)值。

1.7 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以“±s”表示，進行正態(tài)性、方差齊性檢驗。 滿足正態(tài)性者，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時選擇LSD 法或SNK-Q 法，方差不齊時選擇Dunnett T3 法；不滿足正態(tài)性時選擇非參數(shù)檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠MTrPs 組織α-tubulin 和MAP-4 免疫熒光雙染結(jié)果

α-tubulin 和MAP-4 在肌細胞和細胞外基質(zhì)均有一定的共表達。 空白組α-tubulin 和MAP-4 主要分布在肌細胞膜與細胞質(zhì)，分布連續(xù)性較好；模型組α-tubulin 分布連續(xù)性和完整性欠佳，在肌細胞內(nèi)表達減少，在細胞外基質(zhì)表達增加，MAP-4 在肌細胞和細胞外基質(zhì)表達均增加；α-tubulin 和MAP-4 在按法組有一定改善。 與空白組相比，模型組α-tubulin表達下降（P＜0.01），MAP-4 表達升高（P＜0.01）；與模型組相比，按法組α-tubulin 表達升高（P＜0.01），MAP-4表達下降（P＜0.01）。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠MTrPs 組織α-tubulin 和MAP-4 免疫熒光雙染

2.2 各組大鼠MTrPs 組織α-tubulin 和MAP-4 Western blot 結(jié)果

與空白組相比，模型組α-tubulin 表達下降（P＜0.05），MAP-4 表達升高（P＜0.05）；與模型組相比，按法組α-tubulin 表達升高（P＜0.05），MAP-4 表達下降（P＜0.05）。 詳見圖2。

圖2 各組大鼠MTrPs 組織α-tubulin 和MAP-4 相對表達情況

3 討論

根據(jù)臨床特點，MTrPs 歸屬中醫(yī)學“筋結(jié)”和“筋痹”范疇，病因病機是機體在急慢性勞損的影響下導致筋傷，氣虛寒凝血瘀導致“筋攣節(jié)痛”，對此類疾病的治療，中醫(yī)常以針刺、艾灸、針刀、推拿和中藥外敷等外治法為主[16]。按法作為經(jīng)典的推拿手法之一，在諸多疼痛疾病中廣泛運用，但是按法對MTrPs 去活化機制研究涉及理論多、研究難度大，是推拿領(lǐng)域里研究的熱點和難點。目前研究表明，按法刺激MTrPs的去活化作用可以分為外周和中樞兩部分。 在中樞水平上，研究結(jié)果表明，按法刺激MTrPs 通過前額葉皮質(zhì)改變自主神經(jīng)系統(tǒng)的活動，以減少主觀疼痛[17-18]。通常認為，在外周水平上，按法刺激可以增加局部血流量，改善代謝環(huán)境，增強局部代謝[19]。 MTrPs 的重要誘因是各種急慢性損傷（如外傷、工作相關(guān)的重復性肌肉損傷、離心運動和醫(yī)源性損傷等），本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，按法刺激可以有效緩解MTrPs 疼痛，降低局部軟組織張力，其機制與調(diào)節(jié)鈣離子通道、增強線粒體能量代謝、促進肌肉組織修復等環(huán)節(jié)密切相關(guān)[5-7]。

雖然按法刺激MTrPs 去活化效應(yīng)機制研究取得了一定的進展，但是在很多方面仍存在不足。 根據(jù)綜合假說，MTrPs 的發(fā)生發(fā)展與運動終板（神經(jīng)肌肉接頭）功能異常、乙酰膽堿堆積、局部循環(huán)與能量代謝障礙、血管活性成分與炎癥因子釋放等多個環(huán)節(jié)組成的惡性循環(huán)有關(guān)[1]。 團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，MTrPs骨骼肌細胞能量代謝下降，異常收縮，并且存在肌節(jié)不規(guī)則排列，A 帶紊亂，M 線模糊甚至消失，Z 線扭曲斷裂，出現(xiàn)水紋樣變等超微結(jié)構(gòu)損傷[20]。細胞骨架是人體內(nèi)環(huán)境中復雜而功能較多的結(jié)構(gòu)之一，是維持細胞功能正常運作的重要環(huán)節(jié)，涉及內(nèi)吞、細胞分裂、細胞內(nèi)運輸、運動、力傳遞、對外力的反應(yīng)及細胞形狀的適應(yīng)與改變等過程，由微絲、微管和中間絲構(gòu)成[21]。在MTrPs 的病理機制研究中，細胞骨架目前仍處“黑箱”狀態(tài)，有待進一步揭示。

在骨骼肌細胞中，微管位于肌原纖維間，并以螺旋方式包繞肌原纖維，向四周擴散，其具有聚合和解聚的動力學特性，在維持細胞形態(tài)、細胞分裂、信號轉(zhuǎn)導及物質(zhì)輸送等過程中起著重要作用[10]。大負荷運動尤其是離心運動，可誘導細胞微管解聚或降解，致使肌纖維超微結(jié)構(gòu)改變[22]。還有研究表明，線粒體動力學改變依賴肌動蛋白和微管蛋白的正常功能[23]。分子構(gòu)成角度的研究發(fā)現(xiàn)，微管是由α 和β 微管蛋白（α-tubulin and β- tubulin）的異源二聚體組裝成長中空聚合物，微管相關(guān)蛋白（microtubule-associated proteins, MAPs）則與微管長軸結(jié)合以防止解聚[24]。在微管損傷時，MAPs 可能通過代償性增加以維持微管穩(wěn)定以減輕損傷[22]。 MAPs 主要包括MAP1、MAP2、Tau 和MAP-4 等，前三者主要存在于神經(jīng)元細胞中，而MAP-4 存在于各種細胞之中，本次實驗著重研究非神經(jīng)細胞，因此選擇MAP-4 作為研究對象。

基于以上研究進展，本研究團隊認為MTrPs 骨骼肌的能量代謝障礙和超微結(jié)構(gòu)損傷可能與微管解聚或降解相關(guān)。 在本實驗研究結(jié)果中，與空白組相比，模型組α-tubulin 表達下降、MAP-4 表達升高；與模型組相比，按法組α-tubulin 表達升高、MAP-4表達下降。 免疫熒光結(jié)果表明，模型組α-tubulin 分布連續(xù)性和完整性欠佳，在肌細胞內(nèi)表達減少，在細胞外基質(zhì)表達增多，MAP-4 在細胞外基質(zhì)表達增多，兩者在按法組有一定改善。以上均表明在MTrPs模型中，微管解聚或降解，導致α-tubulin 表達下調(diào)、MAP-4 表達上調(diào)，則可能為一種代償性增加，以穩(wěn)定微管，同時α-tubulin 和MAP-4 表達模式發(fā)生改變，在細胞外基質(zhì)中表達增加，這可能與之前觀察到的細胞外基質(zhì)增生、成纖維細胞增加等現(xiàn)象有關(guān)[7]，通過按法干預(yù)可以有效緩解上述病理改變。 在前期研究中，本研究團隊發(fā)現(xiàn)MTrPs 肌肉細胞內(nèi)鈣離子通道蛋白異常表達[5]，而細胞內(nèi)鈣超載可引起微管損傷[25]，在按法干預(yù)后鈣離子通道蛋白表達恢復，這可能是按法調(diào)控微管解聚的重要途徑之一。

綜上所述，MTrPs 造模后，骨骼肌微管蛋白解聚或降解增加，而按法干預(yù)大鼠MTrPs 可以減少微管蛋白解聚并促進其合成，促使其結(jié)構(gòu)和功能正常化，這可能是按法舒筋解結(jié)效應(yīng)的重要科學內(nèi)涵之一。