益氣清熱活血方不同制劑對創(chuàng)傷性肌肉損傷兔肌肉組織中水通道蛋白-1及血清白細胞介素-8表達水平的影響

佘銳豪，蔣順琬，鐘 靜，何富平

(廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院/深圳市中醫(yī)院骨傷科，廣東 深圳 518033)

創(chuàng)傷性肌肉損傷是最常見的損傷之一，也是臨床上最常見的運動性疾病之一[1]。肌肉損傷分為挫傷、拉傷、撕裂傷[2]。美國的調(diào)查研究顯示，挫傷、拉傷約占所有運動損傷的90%[3]，其中由鈍器、非穿透性物體撞擊所造成的肌肉挫傷最為常見[4]。臀部肌肉是骨骼肌挫傷的最常見部位之一，人類身體下肢出現(xiàn)挫傷的概率更大[5]，在臨床上屢見不鮮，尤其多見于運動員、下肢不穩(wěn)的老年人、搬運工等。創(chuàng)傷性肌肉損傷可引起局部發(fā)熱、疼痛、腫脹、皮下淤血[6]，甚至影響肢體功能，臨床處理不當或不及時，會對肌肉容量產(chǎn)生持續(xù)性的影響以及難以逆轉(zhuǎn)的損害。康復緩慢、治療方式不當而出現(xiàn)運動功能不全的患者，有發(fā)生二次損傷和瘢痕組織形成的風險[2]。

我國傳統(tǒng)醫(yī)學在治療創(chuàng)傷性肌肉損傷方面有著豐富的經(jīng)驗和得天獨厚的優(yōu)勢，自漢代起，中醫(yī)外科學就起著舉足輕重的作用，其流傳至今仍有許多中藥外用制劑，如酊劑、油劑、軟膏劑、膏藥、散劑等[7]。到了近代又發(fā)展出了橡膠貼膏劑、靶向制劑、巴布膏劑等[8-9]，其中巴布膏劑自20世紀傳入我國后，以其載藥量大、不污染衣物、對皮膚刺激性小、保濕性良好等優(yōu)點被廣泛使用[10]；近年來其工藝日漸成熟而逐步走向工業(yè)化，大量投入臨床應用。但在與中醫(yī)藥結(jié)合時，因復方藥大多組成復雜，成分繁多，提取困難，中藥巴布膏的療效容易受到影響[11]。因此，在臨床使用中藥外用制劑治療創(chuàng)傷性肌肉損傷時，同一復方制備的傳統(tǒng)工藝和現(xiàn)代制劑的治療效果對比一直存在爭議，其中傳統(tǒng)浸漬劑和現(xiàn)代巴布膏貼劑均是當前被廣泛運用于臨床的制劑，但關(guān)于二者療效對比的動物實驗尚未見相關(guān)報道。基于此，本研究比較了清熱益氣活血方的傳統(tǒng)浸漬劑與現(xiàn)代巴布膏貼劑治療兔創(chuàng)傷性肌肉損傷的效果，旨在為清熱益氣活血巴布膏在臨床中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40只3月齡普通新西蘭雄兔由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，體質(zhì)量200～350 g。將兔置于(24±1)℃的環(huán)境中，進行12 h/12 h的光暗循環(huán)，每日定時清理并更換新鮮墊料，保證充足且適量的食物和水。實驗前實驗主要人員與雄兔共處1周。本實驗遵循赫爾辛基宣言和中國相關(guān)法律法規(guī)，獲得深圳市中醫(yī)院實驗動物管理及倫理委員會批準。

1.2 主要藥物、試劑與儀器清熱益氣活血浸漬液(院內(nèi)制劑，由黃芪、黃連、黃芩、梔子、地榆、大黃、紅花、冰片等中藥組成，除冰片外其余藥材用清水漂洗1遍，加入蒸餾水并進行煎煮得到煎煮液，將冰片溶于體積分數(shù)95%乙醇后加入煎煮液，裝瓶加鋁蓋高溫滅菌后備用)、清熱益氣活血巴布膏貼(院內(nèi)制劑，由黃芪、黃連、黃芩、梔子、地榆、大黃、紅花、冰片等中藥組成，以上藥物用乙醇回流提取，過濾，回收乙醇，制成浸膏。并將上述浸膏加入由聚丙烯酸鈉、聚乙二醇、羧甲基酸鈉、明膠為主要材料制成的半固體基質(zhì)中，充分攪拌均勻并再次過濾，涂布蓋襯制成后備用)、不含藥物的巴布膏貼(除不含藥物，余制法同清熱益氣活血巴布膏貼)，80 g·L-1硫化鈉脫毛劑、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)購自德國ASPEN公司，RNA Loading Buffer購自日本TaKaRa公司，TRIzol試劑、無水乙醇購自上海國藥集團化學試劑有限公司，SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)購自天根生化科技(北京)有限公司，兔白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自江蘇蘇聯(lián)科生物科技有限公司，水通道蛋白-(aquaporin-1,AQP-1)抗體購自美國Genetex公司，蛋白Marker購自美國Thermo公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)儀購自瑞士Roche公司，酶標儀購自中國無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司，臺式離心機購自上海安亭科學儀器廠，水浴鍋購自金壇市江南儀器廠，DNA電泳系統(tǒng)及電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，超低溫(-80 ℃)冰箱購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組、干預及損傷癥狀評分將40只兔隨機分為空白組、模型組、浸漬組和巴布膏組，每組10只。空白組兔不給予任何干預措施；模型組、浸漬組和巴布膏組兔參照文獻[5,12-13]制備創(chuàng)傷性肌肉損傷模型。造模前對兔右側(cè)大腿外側(cè)根部直徑2.5 cm區(qū)域進行脫毛，脫毛后由3名人員分別對兔進行損傷癥狀評分[14]，剔除評分>1分的兔。其中空白組剔除1只兔，其余兔均符合要求進行造模(平均癥狀損傷評分>2.5分視為造模成功)。造模成功后40 min，模型組兔用不含藥物的巴布膏貼劑貼于患處，并用醫(yī)用膠布加強固定，每日1次，每次10 h；浸漬組兔用棉簽蘸取適量清熱益氣活血浸漬液涂擦于患處，每日3次；巴布膏組兔用清熱益氣活血巴布膏貼劑貼于患處，并用膠布加強固定，每日1次，每次10 h。治療24、72 h后由3名實驗外人員分別對兔獨立進行損傷癥狀評分(皮下淤血、肌肉腫脹、肌肉顏色)，并計算平均分。

1.3.2 ELISA法檢測血清中IL-8水平治療24 h后分別于各組隨機選取5只兔(治療72 h后選取剩余兔)，將兔仰臥位固定于兔臺，捫及心臟搏動最強點，以此為圓心將周圍直徑約2 cm的區(qū)域脫毛、標記、消毒，采集10 mL血液[15]，裝入一次性真空負壓含乙二胺四乙酸二鉀抗凝管。當天全部樣本采集結(jié)束后，離心取血清，采用ELASA法檢測血清中IL-8水平。從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4 ℃。設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加入不同濃度的標準品50 μL。樣本孔中加入待測樣品50 μL；空白孔不加。除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化酶標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350 μL)，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，反復洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min后在450 nm波長處測定各孔的吸光度(absorbance，A)值。以標準品的A值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程，將樣品的A值代入方程，計算樣品的濃度。

1.3.3 熒光定量PCR法檢測肌肉組織中AQP-1 mRNA的表達測完血清中IL-8水平后麻醉處死各組兔，將兔固定于兔臺，充分暴露右側(cè)大腿外側(cè)，取打擊區(qū)域中心一塊約1 cm×1 cm×1 cm新鮮組織，PBS清洗后剪碎(任一方向<0.5 cm)，置于-80 ℃冰箱保存。當天全部樣本采集結(jié)束后，采用TRIzol法提取RNA樣品，并使用酶標儀進行定量，采用A260/A280判斷RNA純度。將RNA樣品進行電泳，同時加入少量RNA酶抑制劑，預防電泳過程中RNA降解影響結(jié)果。取RNA樣本1 μg加入引物1 μL，無酶水加至12 μL，65 ℃水浴5 min。冰上操作，依次加入反應緩沖液4 μL、RNA酶抑制劑 1 μL、脫氧核糖核苷三磷酸 2 μL及反轉(zhuǎn)錄酶1 μL；依次25 ℃水浴5 min、42 ℃水浴60 min、72 ℃水浴5 min得到cDNA樣品。AQP-1上游引物序列為5′-CTTCAACAACCACTGGATCTTCTG-3′，下游引物序列為5′-GTTGATGTCATCGCCGTCCA-3′；以β-actin為內(nèi)參，其上游引物序列為5′-CTTCAACAACCACTGGATCTTCTG-3′，下游引物序列為5′-GTTGATGTCATCGCCGTCCA-3′。取cDNA樣品及引物進行熒光定量PCR反應，反應條件：95 ℃預變性15 min、95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循環(huán)45次，計算Ct值。采用2-△△Ct法計算AQP-1 mRNA相對表達量,實驗重復3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 4組兔損傷癥狀評分比較結(jié)果見表1。脫毛后，4組兔損傷癥狀評分比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模后和治療24、72 h時，模型組、浸漬組和巴布膏組兔損傷癥狀評分顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。造模后、治療24 h時，模型組、浸漬組和巴布膏組兔損傷癥狀評分比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療72 h時，浸漬組和巴布膏組兔損傷癥狀評分顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；浸漬組與巴布膏組兔損傷癥狀評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 4組兔損傷癥狀評分比較

空白組兔不同時間點損傷癥狀評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組、浸漬組、巴布膏組兔造模后及治療24、72 h時的損傷癥狀評分均顯著高于脫毛后，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組兔治療24、72 h時的損傷癥狀評分與造模后比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組兔治療 72 h時的損傷癥狀評分顯著低于治療 24 h 時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。浸漬組兔治療 24 h時的損傷癥狀評分與造模后比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；浸漬組兔治療72 h時的損傷癥狀評分顯著低于造模后，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；浸漬組兔治療72 h時的損傷癥狀評分顯著低于治療24 h時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。巴布膏組兔治療24、72 h時的損傷癥狀評分顯著低于造模后，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；巴布膏組兔治療72 h時的損傷癥狀評分顯著低于治療24 h時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 4組兔血清中IL-8水平比較結(jié)果見表2。治療24 h時，模型組、浸漬組、巴布膏組兔血清中IL-8水平均顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；浸漬組與模型組兔血清中IL-8水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；巴布膏組兔血清中IL-8水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；巴布膏組與浸漬組兔血清中IL-8水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療72 h時，模型組、浸漬組、巴布膏組兔血清中IL-8水平均顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；浸漬組、巴布膏組兔血清中IL-8水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；巴布膏組與浸漬兔血清中IL-8水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 4組兔血清中IL-8水平比較

空白組、模型組兔治療24 h時與治療72 h時血清中IL-8水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。浸漬組、巴布膏組兔治療72 h時血清中IL-8水平顯著低于治療24 h時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 4組兔肌肉組織中AQP-1 mRNA相對表達量比較結(jié)果見表3。治療24 h時，模型組、浸漬組、巴布膏組兔肌肉組織中AQP-1 mRNA相對表達量顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組、浸漬組、巴布膏組兔肌肉組織中AQP-1 mRNA相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療72 h時，模型組、浸漬組、巴布膏組兔肌肉組織中AQP-1 mRNA相對表達量顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；浸漬組和巴布膏組兔肌肉組織中AQP-1 mRNA相對表達量顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；巴布膏組與浸漬組兔肌肉組織中AQP-1 mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 4組兔肌肉組織中AQP-1 mRNA相對表達量比較

空白組、模型組兔治療24 h時與治療72 h時肌肉組織中AQP-1 mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；浸漬組、巴布膏組兔治療72 h時肌肉組織中AQP-1 mRNA相對表達量顯著低于治療24 h時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

骨骼肌組織暴露于人體最外層，作為保護人體免于外傷的第1道屏障，在各類損傷中首當其沖。隨著對骨骼肌研究的深入，越來越多的學者開始關(guān)注結(jié)締組織的作用[16-17]。創(chuàng)傷性肌肉損傷是常見的運動損傷之一，當肌肉受到突然而沉重的鈍器打擊時會發(fā)生肌肉挫傷，肌纖維撕裂、組織出血和水腫是肌肉急性損傷的典型特征[18-19]。肌纖維遭受破壞后，隨即出現(xiàn)出血、腫脹及炎癥反應，細胞內(nèi)IL-8、AQP-1等炎癥因子浸潤[20-24]。之后IL-8、AQPs等炎癥因子作為中性粒細胞的主要化學引誘劑，對中性粒細胞進行誘導趨化，進而誘發(fā)中性粒細胞的“呼吸爆發(fā)”，進一步加重炎癥反應。因此，IL-8、AQP-1也被視為炎癥反應的重要相關(guān)指標[25-28]。基于此，本研究通過比較益氣清熱活血方的浸漬劑與巴布膏劑對創(chuàng)傷性肌肉損傷雄兔肌肉組織中AQP-1和血清中IL-8表達水平的影響，探討益氣清熱活血方不同制劑治療創(chuàng)傷性肌肉損傷的效果。

崔曉娟等[29]認為，清熱活血中藥具有一定的抗炎作用。臨床和動物實驗證明，清熱益氣活血外治法治療肌肉損傷療效顯著[12,30]。傳統(tǒng)中藥外用制劑有酊劑、油劑、膏劑、浸漬劑等[31]，其中浸漬劑以其制取方便、使用快捷、療效顯著而被廣泛使用。但浸漬劑存在需要多次涂擦、晾干，患者等待的時間較長及涂擦范圍大、涂擦后易留下藥液痕跡和氣味等缺點。本研究團隊多年來運用清熱益氣活血外治法治療創(chuàng)傷性肌肉損傷積累了一定經(jīng)驗，并以“黃連解毒湯”化裁(黃芪、黃連、黃芩、梔子、地榆、大黃、紅花、冰片)為主要藥物，利用現(xiàn)代巴布膏制劑工藝制成了“清熱益氣活血巴布膏”，欲在運用清熱益氣活血方快速解決病痛的同時，與具有透氣性強、黏合性高、防水性好、過敏反應低等有優(yōu)點的巴布膏劑相結(jié)合，給患者帶來更好的治療效果。本研究中用到的2種中藥外用劑型——清熱益氣活血浸漬劑、清熱益氣活血巴布膏劑，均為本院院內(nèi)制劑，中藥成分相同。

在本研究中，因脫毛劑使用不當，致空白組1只兔右側(cè)大腿外側(cè)出現(xiàn)明顯灼傷及皮損，為排除影響，將該樣本剔除。本研究結(jié)果顯示，脫毛后各組兔損傷癥狀評分比較差異無統(tǒng)計學意義；造模后，模型組、浸漬組、巴布膏組癥狀損傷評分均顯著高于空白組，說明造模成功。模型組兔治療24 h時損傷癥狀評分與造模后比較差異無統(tǒng)計學意義，IL-8、AQP-1顯著高于空白組，治療72 h時各指標較于 24 h 均出現(xiàn)輕微的下降趨勢，這說明在自然狀態(tài)下，兔受到創(chuàng)傷性肌肉損傷后在炎癥刺激下IL-8、AQP-1水平均明顯升高，并持續(xù)一段時間，在72 h后開始緩慢下降。實驗中觀察到，雄兔大腿具有較強的自愈能力，造模后2～3 d往往可以觀察到較為明顯的癥狀緩解及恢復。治療24 h后，浸漬組兔損傷癥狀評分、IL-8水平較模型組有輕微下降，而AQP-1較模型組有輕微上升，但差異均無統(tǒng)計學意義；同時，巴布膏組與模型組損傷癥狀評分、AQP-1 mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計意義，僅2組的IL-8比較差異有統(tǒng)計學意義。這說明治療24 h后，清熱益氣活血方的不同制劑并未明顯起效。治療72 h后，浸漬組與巴布膏組兔癥狀損傷評分、血清中IL-8水平和肌肉組織中AQP-1表達量均較治療24 h 顯著下降，且顯著低于模型組；浸漬組與巴布膏組兔上述各指標比較差異無統(tǒng)計學意義。這說明治療72 h后，清熱益氣活血方的2種制劑均可有效改善創(chuàng)傷性肌肉損傷兔的上述各項指標。

綜上所述，清熱益氣活血方治療創(chuàng)傷性肌肉損傷效果顯著，這種效果可能與抑制AQP-1及IL-8的表達有關(guān)，且浸漬劑與巴布膏劑的治療效果接近。在臨床上使用時，清熱益氣活血浸漬劑具有制取方便、使用快捷、價格更低廉的優(yōu)點，是治療創(chuàng)傷性肌肉損傷不錯的選擇，而對于一些對外觀、治療時間有要求的患者來說，可以選擇清熱益氣活血巴布膏進行治療。另外，本實驗在制備創(chuàng)傷性肌肉損傷模型時發(fā)現(xiàn)，用成年雄兔制備模型存在2個問題：一是成年雄兔毛生長迅速，容易遮擋視野，干擾損傷癥狀評分；二是成年雄兔大腿肌肉發(fā)達，自愈能力強，在造模后72 h往往可以觀察到雄兔狀態(tài)好轉(zhuǎn)和癥狀緩解，因此，在制備創(chuàng)傷性肌肉損傷模型時可以考慮使用大鼠。未來可對2種制劑進行臨床研究，以進一步驗證2種制劑的臨床治療效果。