組蛋白去乙酰化酶9基因rs73307079位點與煙霧病發生風險的關系

彭俊宇，邢紅霞，吳亦琦，劉夢豪，左書茜，張雪薇，邢瑤平，李超堃，趙新利

(1.新鄉醫學院第一附屬醫院神經內科，河南 衛輝 453100;2.新鄉市運動障礙性疾病重點實驗室，河南 新鄉 453003;3.新鄉醫學院第三附屬醫院神經內科，河南 新鄉 453003;4.新鄉醫學院基礎醫學院生理學與病理生理學教研室，河南 新鄉 453003;5.河南省生物精神病學重點實驗室，河南 新鄉 453002；6.新鄉醫學院第一附屬醫院神經外科，河南 衛輝 453100)

煙霧病(moyamoya disease,MMD)是一種血管造影表現為顱內特定部位動脈狹窄或閉塞，并伴有煙霧樣血管增生的腦血管疾病[1-2]。MMD常表現為腦梗死、短暫性腦缺血發作、蛛網膜下腔出血、腦實質出血、認知障礙、頭痛、癲癇發作等，是兒童和青年卒中的原因之一[3-4]。目前，MMD的病因尚未闡明，有研究表明，遺傳因素在其發生及進展中占據重要地位[5-6]。多項研究表明，組蛋白去乙酰化酶9(histone deacetylase 9,HDAC9)基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)與顱內大血管病變所致卒中相關[7-12]。MMD為一種顱內大血管病變且主要表現為卒中，因此，推測HDAC9基因SNP位點與MMD可能存在一定關聯。DUAN等[13]的一項全基因組關聯研究表明，HDAC9基因rs73307079位點與中國漢族人群MMD的發生存在關聯。基于此，本研究通過探討MMD患者HDAC9基因rs73307079位點與MMD發生風險的關系及該位點不同基因型對HDAC9基因表達的影響，以期定位MMD的易感基因及其生物學功能。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2019年9月至2020年12月于新鄉醫學院第一附屬醫院神經內科及神經外科就診的54例MMD患者為MMD組，患者均符合MMD診斷標準[14]，排除由動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病、顱內感染、顱內腫瘤、唐氏綜合征、神經纖維瘤病、頭部接觸放射性及腦外傷因素所致的顱內煙霧樣腦血管病變者。另選擇53名性別、年齡與MMD組匹配的健康體檢者作為對照組。MMD組：男26例，女28例；年齡20～71(51.70±11.08)歲。對照組：男25例，女28例；年齡26～74(52.19±10.22)歲。2組受試者的性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經過醫院醫學倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書，并簽署知情同意書。

1.2 HDAC9基因rs73307079位點SNP檢測

1.2.1 血液基因組DNA提取采集所有研究對象空腹外周靜脈血6 mL于乙二胺四乙酸試管中。使用血液基因組提取試劑盒(北京天根生化科技公司)提取基因組DNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。使用WD9409B紫外分析儀檢測DNA的濃度及純度,置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 HDAC9基因rs73307079位點引物設計與合成通過NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)SNP數據庫查詢HDAC9基因rs73307079位點所在位置及附近DNA序列，應用Oligo Analyzer軟件設計擴增引物，并通過NCBI網站Nucleotide BLAST程序檢驗引物特異性。rs73307079位點上游引物序列為5′-CTCTTCATTTATCTTTCCTCC-3′，下游引物序列為5′-GCCAGGTATTGTTTTAAGTTC-3′。rs73307079位點引物由鄭州久是生物技術有限責任公司合成。

1.2.3 HDAC9基因rs73307079位點DNA片段獲取采用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)法擴增HDAC9基因rs73307079位點DNA片段。PCR反應體系：基因組DNA 1 μL，上、下游引物各1.5 μL，2×Taq Master Mix 25 μL，雙蒸水21 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃終末延伸10 min。

1.2.4 PCR產物測序及基因分型將PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳后，應用紫外凝膠成像儀成像，選取單一條帶的PCR產物，將其送蘇州金唯智生物科技有限公司行DNA Sanger測序，將所測序列比對正常序列，應用Chromas軟件讀取測序峰圖以得出所有受試者的HDAC9基因 rs73307079位點基因型。

1.3 實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測HDAC9基因 mRNA相對表達量從MMD組中分別隨機選擇HDAC9基因 rs73307079位點 TT、TC、CC基因型患者各5例。使用TRIzol試劑從患者血液樣本中提取總RNA，使用反轉錄試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)將RNA反轉錄為cDNA，并進行qRT-PCR。反應體系：2×SYBR Green qPCR Master Mix 7.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，cDNA模板2.0 μL，滅菌雙蒸水4.0 μL。反應程序：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環。HDAC9基因上游引物序列為5′-CCTTCTTTGCCCAACATTACCT-3′，下游引物序列為5′-CACCTTGCCTAAGCGTCTGC-3′；內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶上游引物序列為5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′，下游引物序列為5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。每個樣本設置3個重復反應孔，采用2-△△Ct法計算HDAC9基因mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 2組受試者HDAC9基因rs73307079位點基因型和等位基因分布比較結果見表1。對照組受試者的基因型分布符合HWE(P>0.05)，樣本具有代表性。MMD組和對照組受試者rs73307079位點均存在TT、TC、CC 3種基因型及T、C 2種等位基因。MMD組受試者TT基因型頻率顯著低于對照組，TC基因型頻率顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。2組受試者的CC基因型頻率比較差異無統計學意義(P>0.05)。2組受試者的T、C 2種等位基因分布比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 2組受試者HDAC9基因rs73307079位點基因型和等位基因分布比較

2.2 不同遺傳模式下rs73307079位點基因型與MMD發生風險的關聯性分析結果見表2。以rs73307079位點多態性為自變量，以是否患有MMD為因變量，經校正年齡、性別后，在不同遺傳模式下進行二元logistic分析，結果顯示，在加性遺傳模型下，TC基因型攜帶者發生MMD的風險顯著高于TT基因型攜帶者，差異有統計學意義(P<0.05)；CC基因型攜帶者與TT基因型攜帶者的MMD發生風險比較差異無統計學意義(P>0.05)。在顯性遺傳模型下，TC+CC基因型攜帶者發生MMD的風險顯著高于TT基因型攜帶者，差異有統計學意義(P<0.05)。在隱性遺傳模型下，CC基因型攜帶者與TT+TC基因型攜帶者的MMD發生風險比較差異無統計學意義(P>0.05)。在超顯性遺傳模型下，TC基因型攜帶者發生MMD的風險顯著高于TT+CC基因型攜帶者，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 不同遺傳模式下rs73307079位點基因型與MMD發生風險的關聯性分析

2.3 rs73307079位點不同基因型MMD患者HDAC9 mRNA相對表達量比較MMD組患者中rs73307079位點TT、TC、CC基因型患者的HDAC9 mRNA相對表達量分別為1.173±0.642、1.123±0.203、1.045±0.386，兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

研究發現，環指蛋白213基因突變能夠顯著增加日本和韓國人群患MMD的風險，但在中國人群中的致病作用較低，且在中國其高突變率地區與MMD高發病地區并不一致，中國MMD患者存在更復雜的致病因素，除環指蛋白213基因外，基質金屬蛋白酶3基因等也被報道與MMD發生存在關聯[4,15-16]。目前，關于我國人群MMD的病因及機制尚未闡明。

MMD作為一種大血管病變，腦卒中是該病常見的發病形式，其可能與既往已報道的相關基因存在關聯[7-10]，這有望為解讀MMD的致病機制及定位新的易感基因提供新的方向。由病例對照研究協會和國際卒中遺傳學協會在歐洲人群中進行的一項全基因組關聯研究表明，HDAC9基因rs11984041位點與大血管病變所致卒中的發生存在關聯[7]。TRAYLOR等[11]的薈萃分析發現，HDAC9基因rs2107595位點能夠明顯增加大血管病變所致卒中患病風險。HAN等[12]通過病例對照研究表明，HDAC9基因rs2389995位點與發生大血管病變所致卒中顯著相關。HDAC9基因作為大血管病變所致卒中最密切的風險位點已被多項研究報道，該基因編碼的HDAC9可以通過組蛋白去乙酰化作用，改變與疾病發生相關的啟動子區域染色質結構或降低相應轉錄因子的轉錄活性來調節基因表達，從而抑制轉錄過程[17]。HDAC9在氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡、血管生成等多種生物過程中發揮重要作用[18-19]。

DUAN等[13]進行的一項全基因組關聯研究表明，MMD組患者HDAC9基因rs73307079位點T等位基因頻率顯著低于對照組。本研究結果顯示，2組受試者的T、C 2種等位基因分布比較差異無統計學意義，這可能與本研究的樣本量較小有關，有限的樣本量不足以顯示這一實際存在的差異。

本研究結果發現，MMD組受試者TT基因型頻率顯著低于對照組，TC基因型頻率顯著高于對照組；此外，在加性遺傳模型下，TC基因型攜帶者發生MMD的風險顯著高于TT基因型攜帶者，提示HDAC9基因rs73307079位點TC基因型攜帶者發生MMD的風險較高，TT基因型攜帶者發生MMD的風險較低。本研究結果中，在加性遺傳模型下CC基因型攜帶者與TT基因型攜帶者的MMD發生風險比較差異無統計學意義，但在顯性遺傳模型下TC+CC基因型攜帶者發生MMD的風險顯著高于TT基因型攜帶者，這可能與TC基因型攜帶者對MMD高易感性有關，同時也說明HDAC9基因rs73307079位點CC基因型和TT基因型攜帶者發生MMD的風險相當且均不高。HDAC9基因rs73307079位點不同基因型攜帶者發生MMD的風險可能存在差異，原因可能為：不同的基因型會產生不同的生物學效應，通過直接影響其所在基因或間接影響其他基因的表達發揮作用。HDAC9基因rs73307079位點TC基因型可作為MMD高風險人群標志物，以協助臨床工作者對該人群盡早進行干預。

基因的3′非編碼區域的SNP位點可調控相應蛋白的翻譯過程，從而影響基因的表達水平[20-21]。rs73307079位于HDAC9基因3′端內含子序列中，該位點的生物學功能未見有文獻進行相關報道。有研究發現，HDAC9基因中另一與大血管病變所致卒中相關的SNP位點rs2107595位于該位點附近，其不同基因型攜帶者外周血中HDAC9 mRNA的表達水平不同，rs2107595位點的不同基因型可能通過影響HDAC9的表達來介導大血管病變所致卒中的發生[22]。本研究通過qRT-PCR檢測rs73307079位點不同基因型攜帶者外周血HDAC9 mRNA的表達水平，結果顯示，該位點不同基因型對HDAC9 mRNA表達無明顯差異，這說明rs73307079位點不同基因型攜帶者增加MMD發病的風險不是通過影響HDAC9的表達來實現的，該位點的功能需要進一步探究。

綜上所述，HDAC9基因rs73307079位點基因型多態性與MMD的發生存在關聯，但不影響HDAC9基因表達水平，該位點的TC基因型攜帶者具有較高的MMD發病風險。