散裝即食食品中金黃色葡萄球菌檢測方法研究進展

◎ 陳志敏

（石家莊市食品藥品檢驗中心，河北 石家莊 050011）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種嚴重危害人類健康的食源性致病菌，是革蘭氏陽性菌的典型代表菌，無芽胞和鞭毛，大多數無莢膜，革蘭氏染色呈陽性[1]。在一定的生長條件下，金黃色葡萄球菌會合成腸毒素且該菌具有較強的菌膜形成能力，廣泛地存在于自然界的空氣、污水等環境中。菌膜是耐藥性傳播的一種潛在載體，研究發現金黃色葡萄球菌存在多重耐藥現象。目前世界各國均把金黃色葡萄球菌列為食品衛生的法定檢測項目。

散裝即食食品是提供給消費者可直接食用的非預包裝食品（含預先包裝但需要計量稱重的散裝即食食品）。相對于預包裝食品而言，散裝食品在制作、銷售過程中，容易受器具、工作人員等環節的污染，更具引發食源性疾病的潛在風險。近年國內外散裝即食食品微生物監測數據顯示，食源性致病菌的檢出比例較高，由金黃色葡萄球菌等食源性致病菌引發的食源性疾病屢見不鮮[2]。正因如此，食品安全國家標準《食品安全國家標準 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[3]應運而生，其中明確規定了金黃色葡萄球菌在各類散裝即食食品中的檢測標準及限量要求。

本文擬對食品中金黃色葡萄球菌目前存在的較常見的檢測方法作系統介紹，以期在散裝即食食品中金黃色葡萄球菌檢測的進一步深入研究以及國家衛生標準的制定提供參考。

1 以傳統微生物分離培養為基礎的檢測方法

《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）[4]中要求將傳統培養法作為金黃色葡萄球菌的檢測方法，該標準是檢測金黃色葡萄球菌的國家強制標準。區楚君等[5]通過改進國家標準方法，挑取疑似菌落在含有質量分數4%瓊脂和體積分數2%乙醇的胰蛋白酶大豆瓊脂上進行分離，分離率由2.61%提至19.98%，可有效避免假陰性結果，提高準確度。測試片法是以傳統培養法為基礎進行商品化后的產物，主要以3M公司的Petrifilm Staph Express Count Plate為代表。董娜等[6]通過優化已有復配比例，并與國家標準方法比對發現，優化已有復配比例得出的結果線性相關性良好，檢出限可達到2 CFU·mL-1，可應用于金黃色葡萄球菌的檢測。此外，研究發現將傳統分離培養法得到的可疑菌株與全自動微生物分析儀或基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜儀聯用以增強檢測結果的時效性、準確性[7-8]。因此，可通過此方法在食品抽檢機構中尤其是散裝即食食品這種流通快、檢測時效要求高的樣品中實現快速、準確檢測。

2 以分子生物學為基礎的檢測方法

2.1 PCR技術

PCR是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）的簡稱，是目前檢測金黃色葡萄球菌的最常用方法之一，具有快速、靈敏、特異性好等優點。但由于食品成分的復雜性及食品加工時可能破壞了DNA且可擴增已死亡的金黃色葡萄球菌DNA造成假陽性結果，限制了PCR技術在檢測食品病原菌上的應用。近年來，以常規PCR為基礎技術的各種新型PCR技術不斷出現，使食品中微生物的檢測愈來愈快捷、簡便，同時彌補了常規PCR技術靈敏度低的缺陷。

2.1.1 實時熒光定量PCR方法

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time，PCR）技術是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次PCR循環后產物總量的方法。因其在檢測通量高、時效性好、靈敏度高等方面的優勢得以迅速發展。范維等[9]建立了同時檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的多重實時聚合酶鏈式反應方法，并對散裝即食肉制品進行檢測，均與國家標準方法檢測結果一致，證明該方法可用于散裝食品中3種致病菌的檢測。

2.1.2 PCR與膜芯片雜交技術

PCR與膜芯片雜交技術是指將采集的樣品通過混合培養基得到濃縮溶液，進而提取并純化DNA后，采用PCR與膜芯片技術聯用檢測樣品中的致病菌。楊丹妮等[10]利用膜芯片的特異與多重PCR結合，檢測9種食源性致病菌，實現了同一平臺同時檢測多種食源性致病菌，在提高檢測通量的同時提高了檢測效率，為食品安全風險監控提供了有效手段。

2.1.3 微滴式數字PCR

微滴式數字PCR（droplet digital Polymerase Chain Reaction，ddPCR）是基于傳統的PCR擴增前對樣品進行微滴化處理的一種新型PCR。趙麗青等[11]將疊氮溴化丙錠與微滴式數字PCR技術結合進行定量檢測金黃色葡萄球菌活菌，檢出限可達到1×102CFU·mL-1，在實際應用中具有極高的應用價值。

2.2 環介導等溫擴增技術

DNA環介導恒溫擴增技術（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP），是一種適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術，其特點是靈敏度高，反應時間短。郭建平等[12]利用金黃色葡萄球菌特異性靶點基因SAR0395建立一種可視化LAMP檢測方法，該方法不需要昂貴的設備且操作簡單，可實現在設備較落后的地區進行金黃色葡萄球菌的快速檢測。

2.3 重組酶聚合酶擴增技術

重組酶聚合酶恒溫擴增技術（Recombinase Polymerase Amplication，RPA）是一種新的核酸等溫擴增技術，依賴于能結合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結合蛋白和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，其反應靈敏性高，特異性強，可以真正實現便攜式的現場、快速核酸檢測。后來旺等[13]建立RPA結合側流層析試紙條的快速檢測方法，其與微生物生化鑒定法總符合率為95.3%。

2.4 實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術

實時熒光核酸恒溫擴增檢測（Real-Time Simultaneous Amplification and Testing，SAT） 方 法 的 靶 標 是RNA，擴增產物也是RNA，且反應全程僅需40 min。李桂金等[14]建立的金黃色葡萄球菌SAT方法，純培養物檢測下限達到1×103CFU·mL-1，其靈敏度高、特異性好、假陽性率低至2.9%，為散裝、預包裝食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測提供參考。

3 結語

以往實驗室日常檢測實際樣品中，預包裝食品中春卷、速凍面筋、速凍餃子等市售速凍米面制品中金黃色葡萄球菌的陽性率較高，目前國家出臺了散裝即食食品的衛生標準，散裝即食食品中以米面為原料的制品、肉制品成為了食品抽查的重點，因此必須加強散裝即食食品食品金黃色葡萄球菌的檢驗能力。傳統國家標準檢測方法仍停留在分離培養、形態觀察、生化鑒定和血清型分型水平，檢測周期較長，且無法對培養難度較大的病原菌進行檢測。雖然以分子生物學為基礎檢測方法檢測時間短、特異性強，但是檢測成本較高、靈敏性相對較低且因不能區分死菌以及活菌導致假陽性率高，某些新型多技術連用檢測方法對實驗條件及工作人員的專業能力要求較高，不能得到普及。因此建立快速、操作簡便、準確度高且經濟的金黃色葡萄球菌檢測方法才能應對散裝即食食品的檢測，從而確保食品安全。