CXCLs通過免疫浸潤對皮膚黑色素瘤患者預后的影響

邵珊珊 黃俊星▲ 張 虎 金紅松

1.江蘇省泰州市人民醫院腫瘤科，江蘇泰州 225300；2.江蘇省泰州市人民醫院急診外科，江蘇泰州 225300

進入21世紀以來，皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）的發病率以每年3%～5%的速度快速上漲[1]。由于其具有高度的惡性和侵襲性，導致大多數皮膚癌患者病死。SKCM 已成為嚴重的公共衛生問題[2]，給社會帶來巨大的經濟負擔。因此，尋找合適的預后標志物對提供新的治療靶點具有重要臨床價值。趨化因子是一個大家族的低分子量（8～14 kDa）趨化細胞因子，其與特定受體結合，并在受體細胞中引發定向趨化運動，調節腫瘤細胞的生長和增殖、血管形成、腫瘤干細胞樣細胞特性、侵襲和轉移[3]，直接和間接地影響腫瘤免疫和癌癥進展。CXC 是這個家族的重要成員[4]，腫瘤微環境中的CXC 趨化因子可以調節免疫細胞轉運和腫瘤細胞活性，起到抗腫瘤免疫的作用，影響患者預后[5]。然而趨化因子CXC 在SKCM 中的表達水平及對預后的影響尚不清楚。有研究報道了CXC 趨化因子在SKCM 中的表達和功能[6]，但尚不清楚哪種CXC 趨化因子可作為SKCM 預后的生物標志物。本研究將從CXC 趨化因子中尋找可作為SKCM 預后的標志物，并試圖揭示其影響SKCM預后的機制。

1 資料與方法

1.1 患者樣本

本研究包括兩個獨立數據集：①腫瘤與癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA），提供了472 位SKCM 患者的轉錄組信息和臨床信息；②組織基因型表達圖譜（genotype-tissue expression，GTEx）的正常人轉錄組信息和臨床信息。TCGA 患者特征下載自http://www.portal.gdc.cancer.gov。GTEx 患者特征下載自http://commonfund.nih.gov。

1.2 Oncomine

Oncomine 數據庫是腫瘤相關基因研究的數據庫，整合了TCGA、基因表達綜合數據庫（gene expression omnibus data base，GEO）和已發表的文獻等來源的RNA 和DNA-seq 數據[7]。在本研究中，利用Oncomine 數據庫檢索功能，導出17 種CXC趨化因子mRNA 在SKCM 中的表達差異圖（設定P-value 閾值為0.05，Fold Change 閾值為2，Gene Rank 閾值為TOP 10%）。

1.3 基因表達譜數據動態分析網站（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）

GEPIA 網站云端包含TCGA 和GTEx 數據庫的9736 個腫瘤樣本和8587 個正常樣本的RNA 測序表達數據[8]。本研究通過使用GEPIA 的“單基因分析”功能來分析16 種CXC 趨化因子在SKCM腫瘤組織和正常組織中的表達差異及在SKCM 不同病理分期的表達情況。利用“生存分析”模塊分析16 種CXC 趨化因子表達水平對SKCM 患者預后的影響。篩選出與臨床病理分期和預后相關的CXC 家族基因。

1.4 TISIDB

TISIDB 是腫瘤免疫相關數據的數據庫，囊括2530 種出版物中的4176 條記錄，記錄了988 個與抗腫瘤免疫相關的基因、高通量篩選和基因組圖譜數據結合分析與T 細胞殺傷或免疫治療相關的基因[9]。本研究中通過TISIDB 網站分析篩選CXC 家族基因與腫瘤浸潤淋巴結細胞的相關性，分析腫瘤免疫特征。

1.5 Cibersort

Cibersort 是基于線性支持向量回歸原理對免疫細胞亞型的表達矩陣進行去卷積的工具，可用RNA-Seq 的數據來估計SKCM 組織中免疫細胞浸潤的相對豐度[10]。然后利用R 語言的Limma 包進行差異分析，根據篩選出的CXC 家族基因表達的高低將SKCM 樣本分組，比較不同表達組織中的免疫浸潤差異。

1.6 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

GSEA 是可下載后免費使用的全基因組表達譜芯片數據分析工具。本研究利用LinkedOnmic 網站模塊[11]，對篩選出的CXC 家族基因的相關基因進行GSEA 富集分析，研究該基因主要影響哪些免疫功能通路。

1.7 統計學分析

使用R 語言（v4.0.0）和相應的R 軟件包進行統計分析，連續變量分析采用Studentt檢驗，進行Spearman 相關分析，P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CXC趨化因子在SKCM中的差異表達

利用Oncomine 數據庫分析16 種CXC 趨化因子在SKCM 中的表達（圖1）。結果顯示，與正常皮膚組織相比，SKCM 患者的CXCL1、CXCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10 轉錄水平顯著上調。CXCL12、CXCL14 轉錄水平顯著下調。CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL6、CXCL7、CXCL11、CXCL13、CXCL16、CXCL17 的轉錄水平無明顯差異。

通過GEPIA 數據庫分析了16 種CXC 趨化因子在SKCM 患者和正常皮膚組織中的表達差異（圖2），結果表明，與正常皮膚組織相比，CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 在腫瘤組織中高表達，差異有統計學意義（P< 0.05），CXCL12、CXCL14 在正常皮膚組織中高表達，差異有統計學意義（P< 0.05），CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL16、CXCL17 的表達差異無統計學意義（P> 0.05）。

2.2 CXC趨化因子與SKCM患者病理分期的關系

通過GEPIA 對CXC 趨化因子與SKCM 患者的病理分期相關性進行單因素方差分析，結果顯示，CXCL4（F=2.620，P=0.035）、CXCL9（F=6.180，P=0.000）、CXCL10（F=6.010，P=0.000）、CXCL11（F=4.950，P=0.000）、CXCL12（F=3.370，P=0.010）、CXCL13（F=4.830，P=0.001）與SKCM 的病理分期顯著相關，差異有統計學意義（P< 0.05），見圖3。CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13 高表達促進SKCM 的進展。因此，本研究結果提示CXC 趨化因子與SKCM 的病理過程密切相關。

2.3 CXC趨化因子對SKCM患者預后的影響

利用GEPIA 數據庫分析16 種CXC 趨化因子與SKCM 患者預后的關系，熱圖（圖4A）顯示了不同CXC 趨化因子的對數比例（log10）。下方和上方（原圖中分別為藍色和紅色）分別表示風險較高和較低。帶有框架的矩形意味著顯著相關。結果表明，CXCL4（P=0.003）、CXCL9（P=0.000）、CXCL10（P=0.007）、CXCL11（P=0.006）、CXCL13（P=0.008）、CXCL16（P=0.016） 與SKCM 患 者預后顯著相關。其中CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL16 在SKCM 中是低風險基因，CXCL4 是高風險基因。同時使用GEPIA Survival Analysis 模塊，分別對CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL16 與SKCM 總生存期（overall survival，OS）的關系進行Log-Rank 分析，結果表明（圖4B），CXCL4（χ2=14.401，P=0.003）低表達的SKCM 患者有更好的OS，CXCL9（χ2=27.887，P=0.000）、CXCL10（χ2=32.733，P=0.000）、CXCL11（χ2=27.194，P=0.000）、CXCL13（χ2=29.958，P=0.000）、CXCL16（χ2=10.819，P=0.004）高表達的SKCM 患者有更好的OS，差異有統計學意義（P< 0.05）。見圖4C～G。

綜合以上結果，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 在SKCM 患者腫瘤組織中高表達，同時又是SKCM 患者預后的低風險基因，即在腫瘤組織中高表達的基因提示預后較好。提示CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 可能具有潛在的抗腫瘤作用。因此，后續將研究這4 種CXC 趨化因子是通過何種途徑影響SKCM 患者預后的。

2.4 CXC趨化因子與免疫細胞浸潤的關系

CXCL 家族基因為趨化因子，勢必會影響腫瘤免疫細胞的浸潤。首先在TISIDB 網站采用Spearman 相關檢驗，分別研究SKCM 患者中CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 可 能 調 控哪些類型的腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）。結果表明，這四種基因與ACT CD8+T、Tem CD8、ACT CD4+T、Tfh、Th1、ACT B、Lmm B、NK 細胞、NKT 細胞、巨噬細胞在SKCM 中呈正相關（圖5、表1）。

表1 趨化因子與免疫浸潤細胞Spearman相關系數列表

運用CIBERSORT 算法計算每位SKCM 患者的22 種免疫細胞豐度，驗證根據CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 基因表達模式確定的SKCM 患者在高表達組和低表達組中腫瘤免疫微環境的差異狀態。結果表明，漿細胞、幼稚B 細胞、Tfh 細胞、巨噬細胞M1、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、活化的NK 細胞等抗腫瘤免疫細胞在CXC 趨化因子高表達的患者中浸潤更高，差異有統計學意義（P< 0.05），見圖6。

2.5 CXC趨化因子的生物過程分析

用LinkedOmic 網絡工具對CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 及其相互作用密切的基因進行GSEA 富集分析，以明確其主要影響的生物過程。結果顯示，炎癥反應、免疫反應、細胞因子介導的信號通路、白細胞趨化性以及細胞對干擾素、白細胞介素和腫瘤壞死因子的反應與SKCM 的發生和發展有關。KEGG 信號通路分析結果顯示，CXC 趨化因子及其相關基因的功能主要集中在趨化因子結合、趨化因子信號通路、細胞因子-受體相互作用、TNF 信號通路、NK 細胞介導的細胞毒性。提示CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 與SKCM 的抗腫瘤免疫力相關。見圖7。以上結果表明，CXC 趨化因子影響SKCM 患者的預后可能與CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 介導的腫瘤免疫浸潤相關。

3 討論

SKCM 是最常見的黑色素瘤類型，占所有黑色素瘤病例的91.2%[12]，為侵襲性皮膚癌，是造成皮膚癌患者病死的主要原因[13]。近年來，腫瘤免疫檢查點抑制劑在SKCM 的治療中已經顯示出顯著的臨床效果，然而，大部分SKCM 患者免疫治療的總體應答率仍有待提高。因此，尋找SKCM 預后特征，對SKCM 患者預后進行分層并制訂精確的個體化治療方案顯得尤為重要。

趨化因子是組織內協調免疫細胞遷移和定位的一種微小的蛋白質分子[14]，其與特定受體結合，是誘導趨化性、促進免疫細胞分化和導致組織外滲的重要分子。在腫瘤微環境中，趨化因子為促進免疫細胞進入腫瘤微環境提供了豐富的“土壤”[15]，分為五個主要家族：CXC、CC、CX3C、XC 和CX，其中CXC 趨化因子在家族中占有重要地位。CXC 趨化因子及其受體在多種細胞中均有表達，能促進血管生成以及腫瘤細胞增殖、存活和擴散[16]。然而，關于CXC 趨化因子在SKCM 中的表達及預后研究卻很少。

本研究應用Oncomine 數據庫和GEPIA 數據庫對16 種CXC 趨化因子mRNA 進行分析。研究結果顯示，8 種CXC 趨化因子（CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14）在SKCM 患者腫瘤組織和正常組織中的表達差異有統計學意義（P< 0.05），其中CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13 高表達促進SKCM 的進展。提示CXC 趨化因子可能與SKCM 的病理過程密切相關。有研究指出，CXCL1通過激活VEGF 途徑促進黑色素瘤細胞的存活、侵襲和增殖[17]。CXCL8 通過維持內皮細胞的增殖和活性促進腫瘤血管生成[18]。CXCL9、CXCL10、CXCL13 通過增強腫瘤血管的通透性促進黑色素瘤的轉移[19]，也可通過抑制T 細胞介導的免疫反應導致腫瘤生長率增加[20]。而CXCL11 在各種人類癌癥的致癌過程中均起到調控作用[21]。以上研究與本研究的數據挖掘結果相吻合。

通過進一步分析CXC 趨化因子與生存率之間的關系，發現CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL16 表達與SKCM 患者OS 密切相關，有研究表明，血小板水平高的患者比CD8+T 細胞水平高和血小板水平低的患者更容易發生轉移，其總體生存率低，而CXCL4 由血小板產生，當CD8+T細胞和血小板之間的平衡被破壞時，CXCL4 可通過抑制CD8+T 細胞功能而影響預后[22]。CXCL9、CXCL10、CXCL11 有幾個相似的特征，其在生物結構和生物功能方面表現出相同的特性，在膀胱癌中可通過招募表達CXCR3 的T 淋巴細胞或通過抑制血管生成而具有有效的抗腫瘤特性[23]。CXCL10 的表達可吸引CTL 進入ESCC 組織，并可能對患者生存起到積極作用[24]，以上研究也驗證了本研究的數據分析結果。

需要注意的是，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 在腫瘤組織中高表達，同時又是預后的低風險因素，提示CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 是SKCM 的重要基因，可能具有某些潛在的抗腫瘤作用。眾所周知，趨化因子是介導免疫細胞趨化和淋巴組織發育的趨化性細胞因子，那么這些趨化因子勢必會影響腫瘤浸潤免疫細胞。CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 影響腫瘤預后的途徑可能與其相關。在TISIDB 網站分別研究泛癌中CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 可能調控的腫瘤浸潤免疫細胞類型。結果表明，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 與抗腫瘤免疫細胞數量呈正相關。運用ciBersort 算法計算出每位SKCM患者的22 種免疫細胞豐度，在高表達CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 的患者中，B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞等抗腫瘤免疫細胞浸潤更高，這可能與更佳的預后相關。

綜上所述，本研究主要確定了4 個CXC 趨化因子成員（CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13），為SKCM 腫瘤發生和發展的重要生物標志物，其表達水平與預后和免疫浸潤密切相關。需要注意的是，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 有共同的受體CXCR3，因此，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 是否通過CXCR3 軸來實現免疫調節尚需進一步驗證。