血清免疫細胞因子在非結核分枝桿菌肺病和繼發性肺結核鑒別中的應用研究

勞穗華 陳 華▲ 梁燕瓊 江穎儀 李俊紅 潘靜潔

1.廣州市胸科醫院重癥結核科，廣東廣州 510095；2.廣州市胸科醫院中醫科，廣東廣州 510095

結核病（tuberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一種慢性、進展性的感染性疾病，是目前全球范圍內細菌感染性疾病致死的主要原因[1]。TB 的主要病理學特征是能夠感染全身器官的壞死性肉芽腫性炎癥[2]，臨床表現為咳嗽、咳痰、發熱、消瘦及無力。引起TB的病原體MTB 俗稱結核桿菌，是一類專性需氧型細菌，因其細胞膜富含脂質而具有“抗酸”特點，臨床上通過抗酸實驗陽性可將其檢測。MTB 可通過呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入人體，從而引發多種組織器官疾病，其中呼吸道感染引起肺結核是最常見的方式，這主要是因為MTB 能夠存在于空氣飛沫微滴中，已感染人群在咳嗽、唱歌等用力呼吸動作時，將帶菌的痰液分散至大氣中，從而感染易感人群。人類暴露于MTB 可導致原發性活動性疾病或無癥狀潛伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI）[3]。全球約四分之一的人群感染MTB，任一時間可能有1500 萬人患活動性結核。非結核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）是指除MTB、牛分枝桿菌與麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌，由于其能夠引起結核樣病變而受到關注。NTM 主要侵襲肺部器官，引發非結核桿菌肺病，其與TB 類似。在臨床中，由于MTB 和NTM 引發的肺病癥狀類似，檢測結果重合（MTB 和NTM 都顯示出對常規圖片快速酸染色方法的陽性檢測結果[4]），故二者鑒別診斷較為困難。

目前，對非結核分枝桿菌肺病（non-tuberculous mycobacterium pulmonary disease，NTM-PD）患者血清中細胞因子含量的變化及其臨床意義尚無相關報道。目前免疫相關因子白介素-2（interleukin-2，IL-2）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在繼發性肺結核（secondary pulmonary tuberculosis，PTB）患者和NTM-PD 患者中是否有區別，是否可以將免疫相關因子IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 作為區分PTB 和NTM-PD 的指標尚未見相關報道。本研究選取PTB 患者和NTMPD 患者作為研究對象，采用酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法檢測血清中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 的水平變化，比較兩組患者的細胞因子受試者工作（ROC）曲線，分析免疫相關細胞因子在PTB 和NTM-PD 中的應用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2021年7—12月于廣州市胸科醫院就診的PTB 患者和NTM-PD 患者作為研究對象。其中NTM 組全部入選，PTB 組采取等距抽樣。最終選取39 例PTB 患者和41 例NTM-PD 患者作為研究對象，分別為PTB 組和NTM 組。PTB 組男6 例，女33 例，年齡21～78 歲，平均（53.69±12.73）歲；NTM 組男7 例，女34 例，年齡21～85 歲，平均（53.49±13.36）歲。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義（P> 0.05），具有可比性。患者及其家屬自愿簽署知情同意書。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

納入標準：NTM 組符合2020年版《非結核分枝桿菌肺病臨床實踐指南》關于NTM-PD 診斷標準[5]，包括臨床肺部或全身癥狀表征、影像學檢查、細菌學檢查。臨床癥狀包括呼吸系統癥狀和/或全身性癥狀；影像學檢查包括胸部X 光檢查發現肺病結節或空洞性陰影，高分辨計算機斷層成像檢查發現多灶性支氣管擴張以及多發性小結節病變等；在排除其他疾病后，細菌學檢查發現：①兩次以上送檢痰標本NTM 培養陽性并鑒定為同一致病菌；②一次以上支氣管沖洗液或支氣管肺泡灌洗液NTM 培養和/或分子生物學檢測為陽性；③經支氣管鏡或其他途徑肺組織活檢發現NTM-PD 組織病理學特征性改變（肉芽腫性炎癥或抗酸染色陽性），并且1 次及以上的痰標本、支氣管沖洗液或支氣管肺泡灌洗液中NTM 培養和/或分子生物學檢測陽性，即可診斷NTM-PD[6]。PTB 組隨機抽取于我院確診為PTB的患者。排除標準：PTB 合并NTM-PD 者，合并嚴重心、肝、腎、脾病變及糖尿病；合并人類免疫缺陷病毒和急性病毒感染，合并肺部其他細菌或真菌嚴重感染等；有腫瘤、精神病、免疫變態反應性疾病病史；妊娠期女性；免疫調節劑用藥史，未經過血常規、肝腎心功能、血氣分析等檢查。

1.2 方法

分別采集兩組患者清晨空腹外周血4 ml，2500 rpm 離心7 min 后收集血清，置于-80℃待用。測定前取出血清并恢復至室溫。采用ELISA 方法檢測血清中免疫相關因子IL-2、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α 的水平變化。

1.3 統計學分析

應用SPSS 23.0 統計學軟件建立數據庫并進行統計學分析，非正態分布計量資料以[M（P25，P75）]表示，多組間比較采用單因素方差分析（ONE WAYANOVA）并進行組間檢驗；若方差齊性，組間比較采用LSD 法檢驗；若方差不齊則組間比較采用Dunnett’t法檢驗。全部雙側檢驗，繪制ROC 曲線分析免疫相關細胞因子在PTB 和NTM-PD 鑒別中的應用價值，P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者IL-2、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α比較

NTM 組患者IL-8 濃度顯著高于PTB 組，IL-2濃度顯著低于PTB組，差異有統計學意義（P< 0.05）；兩組患者IL-6、IL-10 和TNF-α 濃度比較，差異無統計學意義（P> 0.05）。見表1。

表1 兩組患者IL-2、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α比較[pg/ml，M（P25，P75）]

2.2 兩組患者各細胞因子的ROC曲線分析

為進一步評價血清免疫細胞因子在兩種疾病中的鑒別診斷作用，對各細胞因子進行ROC 曲線分析。結果顯示，TNF-α 和IL-8 曲線下面積>0.5，差異有統計學意義（P< 0.05）；IL-6 曲線下面積>0.5，但差異無統計學意義（P> 0.05）；IL-2 和IL-10 曲線下面積<0.5。各細胞因子用于診斷的最佳cut-off 值，以及PTB 和NTM-PD 鑒別診斷中的敏感度和特異度見表2、圖1。

表2 兩組患者各細胞因子的ROC曲線分析

2.3 細胞因子聯合檢測在鑒別兩組患者中的ROC曲線分析

用多元邏輯回歸運算得IL-2、IL-8 和IL-10三種細胞因子聯合檢測的曲線下面積大于任一單一細胞因子檢測的曲線下面積，聯合檢測的曲線下面積為0.793（95%CI：0.696～0.890），差異有統計學意義（P< 0.05）。見圖2。

3 討論

TB 是由MTB 感染引起的慢性傳染性疾病，以侵犯肺部常見，在全世界流行，引起數億人的死亡。NTM 是指MTB 及麻風分枝桿菌外的其他分枝桿菌，可引起全身各處組織器官乃至全身范圍內的傳染性疾病。多層螺旋CT 一直是NTM-PD 的主要診斷標準之一，但NTM-PD 與PTB 兩者的CT 表現相似容易混淆[7]。兩者的治療方案差異較大，使用的藥物有所不同，藥物治療帶來的不良藥物反應也會對患者造成較大負面影響。目前，鑒別NTM-PD 與PTB 僅靠分枝桿菌培養后行菌種鑒定，用時長且檢測度低，核酸擴增試驗（NAAT）/Xpert MTB/RIF 檢測系統的廣泛可獲得性使NTM 與MTB 感染早期區分開來[8]。較新的分子鑒定方法，即16sRNA 測序、線探針分析和基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）是目前較為先進的方法[9]。分子檢測有助于NTM-PD 的早期診斷和與MTB 復合體（MTBC）的鑒別。但其花費較高，在臨床上使用局限性較大，仍需探索在臨床上有實用價值的檢測方法。

多種細胞因子參與MTB 感染及NTM-PD 形成的全過程。有報道指出，TB 發病過程中Th1/Th2免疫失衡是其病程發展的重要因素[10-11]。Th1 細胞分泌IFN、IL-2、IL-12、TNF-α 等細胞因子，在抗病原體感染中發揮主要作用；Th2 細胞分泌IL-4、IL-10 等細胞因子，主要參與組織損傷修復[12]。這兩類細胞分泌的細胞因子是TB 免疫應答的主要細胞因子[13]。

本研究對PTB 和NTM-PD 患者血清免疫細胞因子進行檢測，檢測了IL-2、IL-6、IL-8、IL-10 和TNF-α 這五種細胞因子，其中IL-8 和IL-2 差異較為顯著，而IL-6、IL-10 和TNF-α 差異不明顯。本研究也通過ROC 曲線分析得出IL-8 的特異度和敏感度相對較高。檢測手法和研究方式不同，各細胞因子的cut-off 值也會有所不同，敏感度和特異度也存在差異，但本研究結果與其他研究結果相似[14-15]。本研究進一步對數據進行分析，發現IL-2、IL-8 和IL-10 三種細胞因子聯合檢測的曲線下面積大于任一單細胞因子的曲線下面積，差異有統計學意義（P< 0.05）。提示多種細胞因子聯合檢測能夠大大提高PTB 和NTM-PD 的鑒別診斷價值。本研究也有不足之處，最終僅納入80 例患者，且未納入健康患者來對比研究細胞因子較正常人的差異，后續還需進一步驗證研究。

綜上所述，IL-8 細胞因子在PTB 和NTM-PD鑒別中有重要意義，IL-2、IL-8 和IL-10 聯合檢測在診斷鑒別PTB 和NTM-PD 方面有臨床價值。