我國鐵皮石斛種質資源遺傳多樣性研究進展

董 薇 安素妨 楊紅旗 余永亮 梁慧珍

（河南省農業科學院芝麻研究中心，河南鄭州 450002）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）又名黑節草，是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，多生于海拔1 600 m以上的山地半陰濕的巖石上，分布于安徽西南部、浙江東部、福建西部、廣西西北部、四川、云南東南部[1]。鐵皮石斛以莖入藥，是我國珍貴的中藥材之一，有“藥中黃金”的美稱，可益胃生津、滋陰清熱[2]。鐵皮石斛中還有多種活性成分如石斛多糖等，能清除體內自由基，提高免疫力[3]，其已被列入藥食兩用產品目錄，市場需求量大，具有重要的開發價值。

1 鐵皮石斛種質資源分類

鐵皮石斛野生資源從云南到河南均有分布，不同地域的鐵皮石斛農藝性狀如株高、莖粗、葉面積、葉長寬比以及含水量、總多糖、水溶性多糖和纖維素含量等方面均存在差異。在理化分析應用前，藥農以“口嚼無渣、黏性強”來判定鐵皮石斛質量的好壞，并將鐵皮石斛分為“硬腳”和“軟腳”2種。丁小余等[4]通過形態解剖，觀察到“軟腳”莖短而柔軟，有黏性，顯微觀察，表皮蠟質豐富，沒有下皮層，橫切面維管束密度小，并且維管束內外側纖維群不發達，尤其適合加工成鐵皮楓斗；“硬腳”莖長質硬，黏性差，不適合加工楓斗。徐 程等[5]通過理化試驗測定含水量、總多糖、可溶性多糖和纖維素含量后發現，江西、廣西、廣東屬“硬腳”（H 型）范疇，云南、福建、湖南、富陽、雁蕩屬“軟腳”（F型）范疇。丁小余等[4]采集分析廣西、貴州、云南三省6個鐵皮石斛自然居群，其中廣西5個族群中2個為“軟腳”，3個為“硬腳”，按照自然居群分類更加細致準確，也更說明了鐵皮石斛在相同省份同樣存在種質資源遺傳多樣性。

2 鐵皮石斛新種質創制

詹忠根等[6]用137Cs γ射線照射鐵皮石斛種胚原球莖，并經農藝性狀觀察和流式細胞儀分析，獲得了一些能夠保持葉片白色條斑或綠色條斑等變異性狀的變異苗，但該變異品種還需要進一步研究是否為純合體。謝小波等[7]用γ射線照射仙斛1號，少數分子標記表現差異條帶；石斛多糖沒有明顯差異，可能原因是突變概率低或者變異少，不足以影響群體石斛多糖水平。另外，兩者在對石斛原球莖的半致死劑量上有分歧。詹忠根等認為在劑量率為5.0 Gy/min時輻照半致死劑量為67.23 Gy；謝小波等[7]認為在1.0 Gy/min劑量率下半致死劑量為86.4 Gy，輻照劑量與半致死劑量在動物和醫學上成反比關系，但在植物上尚不明確。

廖蘇梅[9]用秋水仙素溶液浸泡鐵皮石斛原球莖或已萌發的種胚后培養得到了鐵皮石斛多倍體，并經過顯微觀察、流式細胞術儀和理化分析，誘變植株都是倍性嵌合體，并且變異株氣孔增大，單位面積氣孔數減少，而保衛細胞內葉綠體數明顯增多，過氧化物同工酶譜有明顯差異，但酯酶同工酶無差異。胡松梅等[10]用硫酸二乙酯對鐵皮石斛原球莖進行化學誘變，得到的一級小苗游離脯氨酸含量比對照株高。

3 鐵皮石斛種質資源表型遺傳多樣性分析

胡衛珍等[11]調查來自臺州、金華、德清、建德、樂清、安吉等基地鐵皮石斛種源的農藝性狀和多糖，結果表明，不同種源之間形態特征如葉片形狀、葉片顏色、葉鞘顏色、莖稈粗細程度、葉鞘是否具有豎條紋、是否帶紫斑、紫斑數量差異較大；多糖含量有顯著差異，莖粗與多糖含量成顯著負相關。史驥清等[12]對不同地域的兩年生以上鐵皮石斛苗進行抗寒性研究，發現各種源鐵皮石斛抗寒性有明顯差異，浙江種源抗寒性最好，福建種源次之。溫婷梅等[13]將福建地區和其他地區的鐵皮石斛農藝性狀進行比較，結果表明，云南鐵皮石斛的植株高差異最小，廣西的差異最大；富陽鐵皮石斛的莖粗差異最小，云南的最大；云南鐵皮石斛的植株葉面積比差異最小，湖南的最大。黃澤豪等[14]顯微鑒別研究福建冠豸山野生鐵皮石斛，發現鐵皮石斛顯微特征比其他石斛明顯，但從顯微鑒別方面很難區分鐵皮石斛生產地域。包英華等[15]徒手切片并對鐵皮石斛進行顯微鑒定，結果顯示，角質層比較薄，厚度約4.9 μm，表皮細胞為不均勻加厚型，表皮細胞壁厚度為12.0～13.0 μm，厚壁組織厚度為 15.7～17.5 μm。

4 鐵皮石斛種質資源分子遺傳多樣性分析

4.1 DNA條碼

DNA條碼是利用生物體內能夠代表該物種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段鑒定物種及物種間親緣關系。目前，該技術已廣泛應用于生物多樣性評估、遺傳多樣性分析、植物藥材真偽鑒定等方面[16-20]。鐵皮石斛的ITS序列和葉綠體rbc L基因與其他石斛間存在特異性序列位點，可以將它們作為鑒別石斛屬種間的條形碼基因[21-22]。丁小余等[23]首次報道了鐵皮石斛的ITS區堿基序列，ITS區的總長度為634 bp，其中ITS1長231 bp，5.8S長163 bp，ITS2長240 bp。在鐵皮石斛廣西、貴州、云南主要居群中，F型與H型居群植株的rDNA ITS區的堿基序列有2個差異位點，變異分別發生在ITS1區和5.8S區內。在F型與H型居群間，其5.8S rDNA區存在單核苷酸多態（SNP）現象，鐵皮石斛居群內部rDNA ITS區的差異與植物生活型的差異成一定的相關性，H型居群的鐵皮石斛是F型的變種。宋劍波等[24]也成功用ITS2序列將30個不同外形江西龍虎山鐵皮石斛樣品分類為9個品種，其種內遺傳距離為0～0.005，6個樣本為龍虎山特有的鐵皮石斛品種。同時，通過建立DNA條形碼的系統發育樹分析表明，6個特有品種變異程度小，由同一分支進化而來。付 濤等[25]研究發現單個條形碼鑒定率均低于60%，核心條形碼matK+rbcL鑒定率也較低（68.75%），但核心條形碼結合其他序列（matK+rbcL+petA-psbJ）鑒定率可達100%，可以用于鐵皮石斛分子鑒定。陳文強等[26]探討目前常用的9條植物DNA條形碼（ITS2、mat K、nad1、ycb L、trn L-trn F、trn G-trn S、psb K-psb I、rbc L和trn H-psb A）在石斛材料分子鑒定中的準確性，發現ITS2和trn L-trn F對試驗選用石斛材料的鑒定率達到90.1%，并且確定鐵皮石斛種質資源鑒定的DNA條形碼ITS2+trn L-trn F為最佳。DNA條形碼和實時熒光定量PCR技術相結合特異性強、靈敏度高、重復性好、經濟高效。陳雪燕等[27]以ITS序列為靶基因，設計鐵皮石斛特異引物、特異探針，使用實時熒光定量PCR（Taq Man）技術，有效鑒定參試樣品中的25份鐵皮石斛。

4.2 SSR標記

石汝杰等[28]利用微衛星序列搜索和統計軟件MSDB v2.4將鐵皮石斛全基因組中完整型微衛星序列和其特征進行生物信息學分析，可為SSR引物篩選提供依據。謝明璐等[29]首次將SSR標記用于鐵皮石斛種質純度鑒定和真實性判別。Yue等[30]、徐蕾等[31]、趙瑞強[32]利用SSR分子標記技術開展不同地方種源的鐵皮石斛遺傳多樣性分析、種群分類等研究，為今后的遺傳輔助育種提供科學依據。董曉曼等[33]使用生物信息學方法分析鐵皮石斛的全基因組SSR序列，將11個滇、皖產區的鐵皮石斛居群分為三支，鐵皮石斛居群與種質來源分布相一致，并篩選了4對多態性高、帶型清晰的引物組合，利用在線二維碼生成器，建立了鐵皮石斛分子身份證。余文霞等[34]使用4對SSR引物對9個鐵皮石斛主產區的29個居群進行檢測分析并構建DNA身份證，聚類分析將樣本分成四大類，并且表現出地域相關性。胡仲義等[35]篩選20對多態性較好的引物，其中DN4+DN10+DN105+DN39的引物組合可作為核心引物使用，用于鐵皮石斛的指紋圖譜構建和遺傳多樣性分析，并且引物 DN4、DN13、DN39、DN58、DN65、DN67、DN10和DN99可以鑒定鐵皮石斛和串珠石斛。

4.3 ISSR標記

沈潔等[36]首次建立了鐵皮石斛的ISSR-PCR分析最適反應體系：PCR反應體系25 μL，配套緩沖液10×Taq酶，Taq DNA 聚合酶 1.5 U，MgCl21.2～1.8 mmol/L，dNTP 80 μmol/L， 引物 0.2 μmol/L，DNA模板約20 ng，退火溫度52～60℃。段媛媛等[37]采用均勻設計和單因素試驗結合的方法，探索出ISSR-PCR擴增穩定性強的反應體系用于鐵皮石斛鑒定：20 μL反應體系，含 2×Taq Master Mix 11.5 μL、模板 DNA 35 ng和引物0.4 μmol/L。沈 穎等[38]首次將ISSRPCR方法用于石斛種間鑒別，選用的10條引物中，7條擴增出多態性條帶，其中2條引物（UBC-807和UBC-864）可獨立區分所有被測樣品，能夠將鐵皮石斛與其他種石斛區分開來，證明了此方法可用于石斛屬種間鑒別。Shen等[39]、李永清等[40]、江金蘭等[41]、鹿 炎等[42]利用ISSR分子標記技術開展不同地方種源鐵皮石斛多樣性分析、種群分類研究。

4.4 RAPD標記

丁鴿等[43]篩選隨機引物對 10個，并通過UPGMA進行聚類分析，共篩選出10個有效引物，擴增得到439個位點，獲得了104條可重現譜帶，其中9條單態條帶，95條多態條帶，多態性達到91.35%，遺傳距離為0.590～0.727，平均為0.686。苑 鶴等[44]篩選15個引物分析浙江義烏、天臺、建德、武義，云南麻栗坡、勐海的14個栽培居群鐵皮石斛和1個紫皮石斛的遺傳多樣性，利用PopGen32軟件進行聚類分析，將14個居群分為兩支：I支包含9個浙江居群（A1-F9），II支包含 2 個浙江居群（G10-H11）和 3 個云南居群（A12-D15），其中H11居群種源并非來自浙江，G10居群種源來源于貴州。居群間親緣關系與地理種源顯著相關，種質資源地理位置相近的具有較近的遺傳基礎。全國主產區的鐵皮石斛在相似系數0.659 0處全部都聚在一起，與其近緣種紫皮石斛存在區別明顯。

4.5 RAMP標記

沈潔等[45]選用RAMP標記16對引物組合，檢測9個鐵皮石斛野生居群的112個樣本，使用NTSYS-pc（version 2.10s）軟件聚類分析，9 個鐵皮石斛的野生居群被分為3個類群，且聚類結果表現出較好的地域相關性。

4.6 SCoT標記

袁晨琳等[46]建立并優化了鐵皮石斛SRAP-PCR反應體系，確定鐵皮石斛SRAP-PCR模板30 ng時的最適宜擴增體系為Taq酶濃度1.5 U、d NTP濃度 0.25 mmol/L、引物濃度 0.10 μmol/L、Mg2+濃度2.0 mmol/L，同時對7個產地鐵皮石斛總DNA進行擴增分析遺傳多樣性，共得到77條條帶，特異性分子標記39個，多態率達到51%，將7個產地鐵皮石斛分為4類，得出其遺傳差異與地理分布之間無較大關聯的結論。徐旭棟等[47]從56個引物中篩選20個SCoT引物，用NTsys-2.1軟件聚類分析，在遺傳系數0.67的水平上，將不同來源的20份人工栽培鐵皮石斛樣品分為兩大類。趙瑞強[32]篩選出28條SCoT引物，共擴增出366條多態性條帶，多態性比率（PPB）為94.76%；17 個居群的多態位點（PPL）為28.83%～64.42%，平均45.73%，聚類結果將不同來源的鐵皮石斛聚在一起，但也有例外。趙瑞強[32]還將SCoT和SSR標記結合鐵皮石斛居群進行多樣性分析，不同居群間表現遺傳多樣性，不同來源鐵皮石斛種質資源的親緣關系與地理緯度關系密切。

4.7 SRAP標記

包英華等[15]從64對SRAP引物的組合中篩選出7對有效引物組合，運用PopGen32軟件將8個居群鐵皮石斛分為4類，并得出居群內遺傳分化偏高于居群間的結論。周麗等[48]采用SRAP標記分析黔西南州野生鐵皮石斛和相關種類石斛的23個樣品的遺傳多樣性，在遺傳相似性系數為0.74處將23份樣品分為6大類，并且SRAP分類結果與植物學形態分類的結果統一。李懷志等[49]使用25對SRAP標記成功構建了20份石斛品系的SRAP特征指紋圖譜。楊 貞等[50]從81對引物中篩選出15對引物，將13份中國不同產地鐵皮石斛材料劃分為3個類群。

4.8 TRAP標記

劉玲[51]篩選8對TRAP引物將9個鐵皮石斛野生居群聚類為四大支。張君毅等[52]開發TRAP和SCAR標記，分析3個鐵皮石斛生態類群的46份種質，并進行野生群體鑒別和抗寒性篩選。以抗寒相關的CBF1/DREB1轉錄因子和鈣依賴型蛋白激酶（CDPK1）基因設計的57對TRAP固定引物中篩選出21個引物組合，分析結果顯示，野生類群鐵皮石斛遺傳多樣性水平最高，而仿野生類群和栽培類群基本一致。主成分分析（PCA）結果將供試材料分為野生和栽培兩大類群。同時，還開發了一個鐵皮石斛轉錄因子（RAP2-4）的SCAR標記，并利用該標記和TRAP固定引物共同篩選出了核心抗寒種質資源。

4.9 CDDP標記

吳永輝等[53]從21條CDDP引物中篩選出16條引物對43份鐵皮石斛野生和栽培種質進行分析，共擴增出了151條帶，其中多態性條帶144條，多態性比率95.4%，遺傳多樣性豐富。通過多態性位點比例（65.56%～82.12%）、種群間基因分化系數（0.110 2）、基因流（4.035 4）的分析，說明人為選擇也可能促進鐵皮石斛遺傳多樣性。

5 展望

鐵皮石斛作為珍稀名貴中藥材，具有重要的藥用價值，應用前景廣闊。隨著分子生物學研究技術手段的不斷更新，鐵皮石斛在分子生物學和多組學技術結合的研究必會越來越深入。