超聲輔助提取裕丹參總黃酮工藝的優化

◎ 倪帆呈，江喜梅，李金貴，楊雙旭，周炎花

（1.漳州科技職業學院，福建 漳浦 363200；2.南京融點食品科技有限公司，江蘇 南京 211399）

丹參，是指唇形科的多年生草本丹參（Salvia miltiorrhizaBge.）的干燥根莖或根。丹參酮、丹參素、丹酚酸、維生素E[1-2]、黃酮類和異黃酮類等化合物均為其主要的活性成分。其中，黃酮具有抗腫瘤、消炎、降血脂、保護神經和抗高血脂等藥理作用[3-6]。當前，常見的黃酮提取方法有酶輔助提取、溶劑浸提法、高速剪切法、回流提取法、超臨萃取法、超聲提取法、發酵法和微波輔助法[7-10]等。

裕丹參享有“丹參之首”的美稱，是地理標志產品（GB/T 22745—2008）。目前研究主要集中于其最主要的兩個成分丹參酚酸和丹參酮[11-12]等，總黃酮的研究較少。本文以裕丹參根為主要原材料，采用超聲波輔助提取黃酮類化合物，以期通過本研究，為促進丹參經濟價值提升及后續相關研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

裕丹參購于河南省方城縣中藥公司；95%乙醇；AlCl3（上海試劑四廠）；KAc（國藥集團化學試劑有限公司）；蘆丁等化學試劑均為分析純。

JA3003A分析天平（上海精天電子儀器有限公司）；V-1600可見分光光度儀（上海美譜達儀器有限公司）；KQ-250DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理方法

參考文獻[13-14]方法，將裕丹參根粉碎，稱取其粗粉2 g，置于錐形瓶中，加入適量一定濃度的乙醇溶液，混勻。置于一定溫度下恒溫水浴，冷凝回流，經一定提取時間，趁熱減壓抽濾。將合并提取液置于100 mL容量瓶，用與提取時相同濃度的乙醇溶液定容，作待測液備用。

1.2.2 總黃酮含量的測定方法

（1）蘆丁標準曲線的繪制。通過查閱相關文獻[15]，采用AlCl3-KAc法測定總黃酮含量。稱取0.011 g蘆丁，用95%乙醇定容至50 mL，作為標準液。再取20 mL標準液，95%乙醇定容至100 mL，作工作液。分別取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL工作液于50 mL容量瓶中，分別向瓶中加2 mL 2.5% AlCl3和9.82% KAc搖勻，30%乙醇定容，靜置30 min于415 nm下測量吸光值。以濃度C（mg·mL-1）為縱坐標，以吸光度A為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程C=1.263 6A+0.000 9，R2=0.999 8（n=6）。

（2）裕丹參根黃酮水分含量的測定。參照《中國藥典》（2020版）通則0832第二法進行。以減失的裕丹參重量為根據，計算其粗粉含水量（%）。

（3）黃酮的提取與測定。取1 mL提取液至50 mL容量瓶中，參照（1）方法測溶液吸光度，對照回歸方程得到黃酮的濃度。裕丹參根黃酮的提取率計算公式為

式中：C為總黃酮濃度，mg·mL-1；V為樣品提取液第一次定容的體積，mL；X為稀釋倍數；m為樣品干重，g。

1.3 黃酮提取工藝的實驗設計

1.3.1 單因素實驗設計

傳統的水煎煮法提取黃酮存在提取時間過長、產品易腐敗等缺點[16]。本法采用乙醇作為溶劑，在此基礎上采用超聲波輔助提取黃酮，將溫度、料液比、提取時間、乙醇濃度4個因素作為考察對象，其中超聲波功率為250 W，各因素的考察范圍如表1所示。

表1 超聲波提取法單因素實驗各因素的考察范圍列表

1.3.2 正交設計實驗設計

在單因素實驗基礎上，系統考察提取溫度、料液比、提取時間、乙醇濃度對裕丹參根黃酮提取率的影響，實驗因素水平如表2所示。

表2 因素水平表

2 結果與分析

2.1 裕丹參粗粉的水分含量

根據1.2.2的方法進行實驗，測得裕丹參粗粉的水分含量為9.918%。

2.2 單因素實驗結果與分析

2.2.1 溫度對裕丹參根黃酮提取率的影響

由圖1可知，當提取溫度低于60 ℃時，黃酮提取率呈上升趨勢，這可能是溫度升高致使裕丹參根黃酮溶解，進而提取率增加[17]。但當提取溫度超過60 ℃后，黃酮提取率開始下降。這可能是過高的溫度使部分對溫度變化比較敏感的黃酮類物質，如酚式結構類被破壞，提取率下降[18]。當提取溫度為60 ℃時，黃酮提取率最高。故最適宜提取溫度為60 ℃。

圖1 提取溫度對丹參根黃酮得率的影響圖

2.2.2 料液比對裕丹參根黃酮提取率的影響

由圖2可知，料液比（g∶mL）在1∶20時，裕丹參根黃酮提取率達到最大，后隨料液比的增大而呈下降趨勢。一定范圍內，料液比的增加會促進黃酮物質的溶解，后隨著料液比的增加，則會出現雜質增加、黃酮類物質的極性發生改變和結構被破壞等情況，從而引起提取率的降低[19]。故料液比為1∶20時較為適宜。

圖2 料液比對裕丹參根黃酮得率的影響圖

2.2.3 提取時間對裕丹參根黃酮提取率的影響

由圖3可知，提取時間小于40 min時提取率無明顯的增加，在提取時間為50 min時提取率最低且提取時間的延長可能會破壞部分黃酮類物質結構。出于時間和能效因素考慮，將提取時間定為20 min為宜。

圖3 提取時間對裕丹參根黃酮得率的影響圖

2.2.4 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

由圖4可知，丹參黃酮提取率整體上波動較小。在乙醇濃度為70%時，提取率達到最大；大于70%時，提取率出現一定的下降。黃酮類物質的組分及其性質對提取率有一定的影響，如在熱水中黃酮苷類溶解度高，在醇等溶劑中黃酮苷元溶解度高[20]。另外，溶劑的極性對黃酮的提取效率也有一定的影響[21]。由結果看來，整體影響較小，故出于成本因素考慮，將乙醇濃度定為50%較為適宜。

圖4 乙醇濃度對裕丹參根黃酮得率的影響圖

2.3 正交實驗結果與分析

由表3和表4可知，影響裕丹參根黃酮得率因素的主次順序為料液比＞提取溫度＞提取時間＞乙醇濃度，其中料液比對結果有顯著影響（P＜0.05）。最佳組合為A1B1C3D3，由于乙醇濃度對結果影響不顯著，出于節約材料考慮，故最終選取工藝為A1B1C3D1，即料液比（g∶mL）為1∶10，提取溫度為50 ℃，提取時間為40 min，乙醇濃度為50%。以此最佳條件下，提取率達到4.81%。

表3 正交實驗結果表

表4 方差分析表

3 結論

（1）以超聲輔助提取裕丹參根總黃酮方案是可行的。料液比在4個考察因素中（提取溫度、料液比、提取時間和乙醇濃度）料液比對結果的影響最大。不同因素對其提取率影響大小可能與此類黃酮的結構和極性有一定的關系，需進一步進行驗證與研究。

（2）以黃酮得率為指標，通過單因素與正交實驗確定提取裕丹參根黃酮的最佳工藝為料液比1∶10、提取溫度50 ℃、提取時間40 min、乙醇濃度50%，其黃酮提取率達到4.81%。

（3）在提取裕丹參根黃酮方面，超聲輔助提取法較水煎煮法具有用時更短、提取效率高、節省樣品等優點。