殼聚糖/原花青素微凝膠制備及其評價

◎ 安 妮，何天豪，余 潔，姜皓琤，嚴禧堃，冉玲玲，葛 建，侯 歡

（1.中國計量大學 生命科學學院，浙江 杭州 310018；2.浙江山嶼海康養產業發展有限公司，浙江 杭州 310011）

近年來，肥胖的發病率在全球范圍內快速上升，與糖尿病、心腦血管疾病的發生都有密切的聯系，而脂肪類膳食攝入過多是引起肥胖、“三高”等慢性病的主要因素[1]。因此，開展天然功能因子的穩定性保護、靶向遞送以及復配探索研究，已成為近年來藥品食品科學的探索熱點與趨勢。

原花青素是植物中提取的具有抗氧化、抗腫瘤、預防和治療心血管疾病等作用的多酚類物質[2-3]，其化學結構中存在大量酚羥基，能夠提供電子，從而中斷自由基反應[4]。天然原花青素廣泛存在于葡萄、茶葉、可可、大麥等植物中。楊梅葉中也富含原花青素[5]。殼聚糖含有氨基、羥基等具有生物活性的功能基團，也具有抗氧化和調節脂質代謝等功效[6]。殼聚糖在腸道內能與膽酸鹽如甘氨膽酸鈉（Sodium Glycyl Acid，GA）或牛磺膽酸鈉（Sodium Taurocholate Acid，TA）結合，干擾膽酸鹽的腸肝循環，促進膽酸鹽排泄，阻止膽汁酸重吸收，促使血漿及肝臟中的膽固醇轉化為膽汁酸，從而起到降血脂的效果。殼聚糖還可以通過吸附膽汁酸，抑制脂肪消化，從而減少機體吸收脂類物質，達到降低血脂的作用[7]。

微凝膠是尺寸在0.1～1 000.0 μm，通過聚合物分子（如多糖、蛋白等）間的交聯形成三維網絡結構的顆粒[8-9]。它表現出無毒、結構穩定、具有生物相容性和可降解性等一系列特殊的性質，具有廣闊的應用空間并具有一定的安全性[10]。殼聚糖等聚合物雖有良好的生物相容性，但無法被人體內消化酶所降解，因此適合用于原花青素等功能因子的定向（結腸）釋放[11]。將殼聚糖與楊梅葉原花青素制成微凝膠后，其生物活性物質在各種環境中的穩定性能夠顯著提高[12]。

本研究采用磁力攪拌制備殼聚糖/原花青素微凝膠，并探究其協同抗氧化作用，通過在體外模擬人體消化環境的實驗，研究不同因素對微凝膠與膽酸鹽結合能力的影響，旨在探討其與膽酸鹽結合的適宜條件，以期為殼聚糖/原花青素微凝膠在藥品食品中的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同聚合度楊梅葉原花青素，實驗室自制；殼聚糖、過硫酸鉀、硫酸亞鐵七水合物，購于上海泰坦科技股份有限公司；2,2-聯苯基-1-苦基肼基（DPPH，生物試劑），購于梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；2,2-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）；二銨鹽（ABTS，生物試劑），購于上海麥克林生化有限公司；甘氨膽酸鈉鹽和牛磺膽酸鈉鹽（純度：95%），購于上海阿拉丁有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-5200紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；高效液相色譜儀（日本島津Shimadzu 20AT）；85-1磁力攪拌器；SC-30A數控超級恒溫槽；XW-80A旋渦混合器；KQ-250B型超聲波清洗器；EL204電子天平；高速離心機（MIKRO 22R，德國 Hettich）。

1.3 實驗方法

1.3.1 微凝膠的制備

將殼聚糖溶于1%醋酸溶液，磁力攪拌至無沉淀，4 ℃保存備用。將楊梅葉原花青素溶于1%乙醇溶液，磁力攪拌 2 h，5 000 r·min-1離心 15 min，用 0.22 μm過濾器過濾，-20 ℃保存備用。取殼聚糖溶液與楊梅葉原花青素溶液按照3∶1（體積比）比例混合置于圓底燒瓶中封口后磁力攪拌2 h，即得殼聚糖/楊梅葉原花青素微凝膠（以下簡稱微凝膠）。

1.3.2 抗氧化能力評價

（1）DPPH自由基清除能力測定。參考柳埃塔爾[13]的方法并稍作調整。分別取200 μL楊梅葉原花青素、殼聚糖以及微凝膠與4.5 mL的100 μmol·L-1DPPH乙醇溶液混合，旋渦振蕩30 s后置于暗處30 min，在517 nm波長下測定其吸光度A1。用水替代樣品溶液作空白組A空白1，乙醇代替DPPH乙醇溶液作對照組A對照1。DPPH清除率計算公式為清除率=［1-(A1-A對照1)/A空白1］×100%。

（2）ABTS自由基清除能力測定。參照凱塔爾[14]的方法并稍作調整，精確稱取0.384 1 gABTS，加乙醇溶解并定容至100 mL。加入0.066 2 g過硫酸鉀，室溫避光條件下靜置過夜12～16 h。臨用前稀釋ABTS儲存液至734 nm波長下吸光度為0.8±0.02，分別取80 μL楊梅葉原花青素、殼聚糖以及微凝膠與3 mL的ABTS反應液混合，混勻后室溫避光反應6 min。然后在734 nm波長下測定其吸光度A2，用水替代樣品溶液作空白組A空白2，乙醇代替ABTS乙醇溶液作對照組A對照2。ABTS清除率計算公式為清除率=［1-(A2-A對照2)/A空白2］×100%。

（3）羥基自由基清除能力測定。參照陳根洪等[15]的方法并稍作調整。稱取0.025 0 g的七水硫酸亞鐵，加水溶解并定容至10 mL。稱取0.012 4 g水楊酸，加乙醇溶解并定容至10 mL。量取0.099 2 mL的30%H2O2，加水定容至100 mL。將0.2 mL的FeSO4溶液、0.2 mL的水楊酸乙醇溶液、0.3 mL的去離子水分別與0.6 mL的楊梅葉原花青素、殼聚糖、微凝膠混合，搖勻后加入0.2 mL的H2O2溶液，于37 ℃水浴加熱反應15 min，然后在510 nm波長下測定其吸光度A3。用水替代樣品溶液作空白組A空白3，乙醇代替水楊酸乙醇溶液作對照組A對照3。羥基自由基清除率計算公式為清除率=［1-(A3-A對照3)/A空白3］×100%。

1.3.3 膽酸鹽檢測方法的建立

（1）色譜條件。參照王鳳雙等[16]的方法并稍作調整。以反相高效液相色譜法測定甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉的含量；色譜柱：Hypersil ODS（150 mm×4.0 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.6%磷酸二氫鉀（65∶35，V/V）；流速：0.5 mL·min-1；檢測波長：205 nm；進樣量：20 μL。

（2）線性關系考察。分別制備濃度為200 μmol·L-1、150 μmol·L-1、100 μmol·L-1、50 μmol·L-1、25 μmol·L-1的相同濃度GA和TA的混合溶液，離心后取上清液進樣測定GA和TA各自的峰面積，繪制標準曲線，建立線性回歸方程，考察線性關系。

（3）精密度實驗。按上述方法制備含有GA和TA 0.05 mmol·L-1、0.10 mmol·L-1、0.20 mmol·L-1的質控樣品，同一日期連續進樣3次，記錄各峰面積，計算RSD，考察日內精密度；于3個不同日期內各連續進樣3次，記錄峰面積，根據每日峰面積平均值計算RSD，考察日間精密度。

1.3.4 微凝膠結合膽酸鹽功效探究

（1）人體胃腸道環境模擬。胃環境模擬：取一定量樣品，加入1 mL 0.01 mol·L-1的鹽酸溶液，在37 ℃恒溫振蕩1 h。腸環境模擬：以0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節胃環境模擬后樣品液pH值為6.3，隨后加入4 mL10 mg·mL-1胰酶，（胰酶以pH6.3的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液配制），在37 ℃恒溫振蕩1 h。

（2）微凝膠功能成分結合膽酸鹽能力探究。經預實驗優化確定膽酸鹽濃度為0.3 mmol·L-1，楊梅葉原花青素濃度為1 mg·mL-1，按“1.3.1”項下配比制作凝膠。分別取微凝膠、殼聚糖/原花青素直接混合物1 mL，經胃腸模擬環境處理后加入4 mL膽酸鹽溶液（TA、GA 濃度均為 0.3 mmol·L-1，用 pH6.3、0.1 mol·L-1磷酸緩沖液配制），恒溫振蕩1 h，4 000 r·min-1離心20 min。對上清液中膽酸鹽含量進行測定。

1.3.5 影響微凝膠與膽酸鹽結合因素研究

（1）離子強度對微凝膠結合膽酸鹽的影響。取1 mL微凝膠，經胃腸模擬環境處理后吸取6 mL，每個樣品中加入4 mL膽酸鹽（GA、TA的濃度設定為0.3 mmol·L-1、0.6 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1，分別以pH6.3，濃度為 0.1 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.9 mmol·L-1的不同離子強度的磷酸緩沖液配制），振蕩，離心。對上清液中膽酸鹽含量進行測定。

（2）尿素對微凝膠結合膽酸鹽的影響。將經胃腸模擬環境處理的微凝膠平均分成兩份，其中一份加入一定量尿素（1.5 mmol·L-1）。取6 mL上述試液，每個樣品中加入4 mL膽酸鹽溶液（GA、TA濃度設定為0.1 mmol·L-1、0.3 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.7 mmol·L-1、0.9 mmol·L-1， 分 別 以 pH6.3 的 0.1 mol·L-1磷 酸 緩 沖液配制），恒溫振蕩，離心。對照為取6 mL未加入尿素試液，其余操作相同。對上清液中膽酸鹽含量進行測定。

2 結果與分析

2.1 抗氧化能力

DPPH清除率檢測法廣泛應用于天然植物提取物的體外抗氧化能力檢測及抗氧化片段篩選[17]。其乙醇溶液呈紫色，當遇到供氫體時，DPPH自由基被還原為DPPH-H，紫色會褪去[18]。由表1可知，微凝膠能有效地清除DPPH自由基，殼聚糖和楊梅葉原花青素的抗氧化能力在DPPH體系中有協同增效作用。

表1 DPPH自由基清除能力表

ABTS清除率檢測法在抗氧化能力的測定中應用較為廣泛。經氧化后的ABTS能夠生成穩定的陽離子自由基ABTS+·，此時溶液呈藍綠色，反應體系加入抗氧化劑后褪色[19]。由表2可知微凝膠抗氧化活性略大于楊梅葉原花青素，殼聚糖對ABTS自由基清除活性小，而二者所制得微凝膠能在一定程度上提高原花青素抗氧化活性。

表2 ABTS自由基清除能力表

羥基自由基會被原花青素中含有的抗氧化成分消除。·OH的強氧化性能夠在水溶液中改變底物的顏色，應用紫外分光光度法測定底物吸光度的改變，間接測定·OH的濃度[20]。據此建立本實驗測定原花青素對羥基自由基清除的方法。由表3可知，相較于殼聚糖和原花青素的單獨使用，二者在制成微凝膠后具有良好的抗氧化協同作用，能夠在一定程度上提高羥基自由基清除能力。

表3 羥基自由基清除能力表

2.2 膽酸鹽檢測方法學考察結果

根據方法中HPLC檢測方法，以GA、TA濃度（μmol·L-1）為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線（圖1），得回歸方程為GA：y=2 353x-14 053（R2=0.996 9），TA：y=1 277.3x-9 456.7（R2=0.997 6）。TA的日內RSD分別為2.63%、4.61%、2.74%（n=3），日間RSD分別為6.23%、4.38%、5.92%（n=3）；GA的日內RSD分別為2.90%、3.36%、3.37%（n=3），日間RSD分別為5.54%、7.05%、2.47%（n=3）。

圖1 甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉標準曲線圖

2.3 微凝膠與殼聚糖/原花青素直接混合物結合膽酸鹽的能力對比

由圖2可知，微凝膠的最佳反應時間位于60 min處，而殼聚糖/原花青素直接混合物的最佳反應時間在90 min處。且60 min時微凝膠的膽酸鹽結合量（TA 0.375 μmol·mL-1、GA 0.258 μmol·mL-1）明顯高于90 min 殼聚糖 /原花青素直接混合物（TA 0.371 μmol·mL-1、GA 0.237 μmol·mL-1）。說明殼聚糖 /楊梅葉原花青素微凝膠體系中存在某種結構，使膽酸鹽的結合具有協同增效能力。

圖2 微凝膠、殼聚糖/原花青素直接混合物與膽酸鹽結合時間的相關性分析圖

2.4 離子強度對微凝膠結合膽酸鹽的影響

如圖3所示，在不同離子強度的緩沖溶液中微凝膠對2種膽酸鹽的結合量不存在顯著性差異（P＞0.05），表明了離子強度對微凝膠結合膽酸鹽有一定影響，但影響不顯著。

圖3 不同膽酸鹽離子強度對微凝膠結合膽酸鹽的影響圖

2.5 尿素對微凝膠結合膽酸鹽的影響

在有尿素存在的情況下進行吸附實驗，以考察氫鍵作用和吸附過程的關系。尿素能夠優先在自身與水之間形成氫鍵，暴露膽酸鹽的活性基團，進而影響膽酸鹽微團的穩定性。在尿素存在的情況下，殼聚糖/原花青素微凝膠對2種膽酸鹽的結合作用結果如圖4所示，結果表明尿素對微凝膠結合膽酸鹽有影響但不顯著（P＞0.05）。

圖4 尿素對微凝膠結合膽酸鹽的影響圖

3 結論

殼聚糖與楊梅葉原花青素都是天然的抗氧化劑，在功能性食品、醫藥及化工等領域具有廣闊的應用前景。經體外抗氧化實驗分析可知，殼聚糖/楊梅葉原花青素微凝膠在ABTS與羥基自由基體系中清除自由基的能力大大增強，抗氧化效果明顯高于楊梅葉原花青素與殼聚糖單獨作用的效果，兩者具有協同增效作用。通過微凝膠與直接混合物的膽酸鹽吸附對比實驗，微凝膠結合膽酸鈉的能力高于殼聚糖和楊梅葉原花青素的共同作用，初步證實了微凝膠結構能夠提升其功能性成分對人體的降血脂功能。另外，離子強度變化和有無尿素條件對殼聚糖/楊梅葉原花青素微凝膠結合膽酸鹽能力均有影響，表明疏水作用力和氫鍵對微凝膠結合膽酸鹽有一定貢獻。本研究為天然功能因子的開發利用帶來了新視角和新途徑，為殼聚糖/楊梅葉原花青素微凝膠在功能性食品、醫藥和化工等領域的應用創新提供了新的思路。