高效液相色譜法測定飲料中10種合成著色劑和2種工業染料

◎ 梁培榮，蔡海華，張 敏，林騰奕

（廣東省食品檢驗所（廣東省酒類檢測中心），廣東 廣州 510435）

食品的色澤一直是對食品質量進行評價的一種重要指標，而食品在生產、運輸和儲存等各環節中均會發生一定的化學或物理變化，導致食品的色澤發生一定程度的改變，因此廠家常使用色素來保持食品色澤。添加食用著色劑可維持食品的原色澤，其根據來源分為天然和合成著色劑。合成著色劑顏色更鮮艷、著色能力更強、著色更穩定持久且價格便宜，但其多以芳烴類化工品為原材料化合形成，作為一種化工產品，若長期食用對人體健康具有潛在危害[1-3]。

為了對合成著色劑進行監管，《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）中對食品合成著色劑的使用作出了規定，其中包括本次監測的檸檬黃、日落黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、酸性紅、赤蘚紅、亮藍和靛藍等。而酸性橙Ⅱ、酸性大紅GR等工業染料具有高毒性，若與人體接觸或被食用會具有“三致”等危害［4-6］。《關于印發全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治抽檢工作指導原則和方案的通知》（食品整治辦〔2009〕29號）將酸性橙等工業染料列為禁用的添加劑。

目前，常見的色素檢測方法有高效液相色譜法[7-10]、毛細管電泳法、示波極譜法等[11-12]，其中高效液相色譜法因儀器靈敏度高、準確性高等優點得到廣泛使用。目前，對于食品中禁用工業染料的測定方法的研究較多，多使用高效液相色譜法［13-14］。GB 5009.35—2016、GB/T 21916—2008和SN/T 1743—2006等標準中規定了部分著色劑的檢測方法[15-17]。這些標準大多只檢測一種或幾種色素，前處理較為復雜，回收率不高，無法同時對多種著色劑和工業染料進行檢測。因此，建立一種能同時測定工業染料和著色劑的高效液相色譜檢測方法具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市場銷售的某品牌飲料；檸檬黃、日落黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、酸性紅、赤蘚紅、亮藍和靛藍標準品（壇墨）；酸性Ⅱ標準品（阿爾塔）；酸性大紅GR標準品（bepure）；甲醇（HPLC，美國Fisher公司）；乙酸銨（HPLC，國藥集團化學試劑有限公司）；實驗用水均為一級水。

1.2 儀器與設備

ACQUITY Arc高效液相色譜儀（配PDA檢測器，美國Waters公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；超聲波清洗器（昆山KQ-500DE型號數控）；高速冷凍離心機（Thermo Heraeus Multifuge X1R）；漩渦振蕩器[艾卡（廣州）儀器設備有限公司]。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取適量固體標準品于50 mL容量瓶中用10%甲醇水溶解并定容至刻度，配制成混合標準溶液。其中，檸檬黃、日落黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、酸性紅、赤蘚紅、亮藍、靛藍和酸性大紅GR配制成濃度為1.00 mg·mL-1的標準溶液；酸性橙Ⅱ配制成濃度為100 mg·L-1的標準溶液。

臨用時用10%甲醇水逐級稀釋成標準工作溶液。其中酸性橙Ⅱ濃度分別為 0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.20 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1和5.00 mg·L-1；其余組分濃度均為 0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1和50.0 mg·L-1。

1.3.2 樣品溶液的配制

準確稱取5 g試樣（樣品含二氧化碳則先水浴加熱除去二氧化碳）于50 mL帶蓋離心管中，加10%甲醇水15 mL渦旋混勻，超聲20 min，以8 500 r·min-1離心5 min，轉移至25 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻。取適量上清液過0.45 μm濾膜，待高效液相色譜測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ChromCore C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A甲醇，流動相B乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）；流速：1.00 mL·min-1；進樣量：10 μL；檢測器：PDA檢測器；檢測波長：254 nm。流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序表

2 結果與分析

2.1 前處理條件的選擇

10種合成著色劑均為水溶性，酸性橙Ⅱ和酸性大紅GR均易溶于水。樣品通過10%的甲醇水溶液超聲20 min后提取，再經離心后轉移定容取上清液，經微孔濾膜過濾后進樣，此操作前處理簡單且回收率好。

2.2 流動相的選擇

參考 GB 5009.35—2016方法，采用 20 mmol·L-1乙酸銨和甲醇的混合流動相體系，通過對洗脫條件的梯度優化，使12種組分獲得較好的分離。優化后的梯度洗脫條件見表1。

2.3 色譜柱的選擇

目前，關于食品添加劑的檢測主要采用C18色譜柱[18-19]。本實驗考察了不同品牌的C18色譜柱對目標化合物的分離效果。結果表明，在ChromCore C18色譜柱上各組分的色譜峰峰形尖銳對稱，柱效高的同時分離度好，能在14 min內完成所有目標物的分離，滿足快速檢測需求。因此，選擇ChromCore C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進行檢測。

2.4 柱溫的選擇

考察了柱溫為30 ℃、35 ℃和40 ℃時對各組分的分離效果。在相同流動相和色譜柱條件下，隨著柱溫的變化，各組分的保留時間變化不大。但當柱溫為30 ℃和40 ℃時，酸性紅和亮藍分離度較小。而柱溫為35 ℃時各組分分離度好且峰形尖銳對稱，故選擇柱溫為35 ℃。

2.5 空白溶劑對測定結果的影響

在相同的提取條件和液相條件下測定，12種組分10%甲醇試劑空白的色譜圖和混合標準品的色譜圖見圖1。由圖1可知，空白提取溶劑對各組分的含量測定未產生影響。

圖1 10%甲醇溶液、12組分混合標準品色譜圖

2.6 方法的線性范圍與檢出限

取配制好的12組分混合標準溶液，按優化后的條件進行分析，以濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），得到各組分的線性回歸方程。檢出限按3倍信噪比計算，結果見表2。由表2可知，各組分線性關系良好，相關系數均大于0.999，檢出限為0.20 ～ 1.00 mg·kg-1。

表2 12種組分的線性回歸方程、相關系數、線性范圍和檢出限表

2.7 方法的加標回收率和精密度

稱取飲料空白基質樣品，按照3個水平進行加標，平行測定8次，另外做2個空白平行，作空白扣除后，計算回收率和相對標準偏差，結果見表3。各組分平均回收率為90.73%～98.84%，相對標準偏差均小于5%。本方法的加標回收率和精密度均滿足實際檢測的要求。

表3 12種組分的回收率和精密度表（n=8）

3 結論

本方法建立了同時測定飲料中的10種合成著色劑和2種工業染料的高效液相色譜法，經驗證本方法前處理簡單、實驗時間短、準確性和重現性好，適合于日常食品中液體樣品中多種著色劑的測定，同時對國家標準中沒有同時檢測工業染料和著色劑的方法進行補充，為食品安全檢測提供一定的參考。